分子標記輔助選擇Pi9基因改良湘晚秈11號的稻瘟病抗性

李枳蒙，張 婷，李 典，黃 俊，賴怡帆，吳婷婷，李博文，劉雄倫，2，3*

(1 湖南農業大學農學院，長沙 410128；2 作物基因工程湖南省重點實驗室，長沙 410128；3 水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，長沙 410128)

水稻(Oryzasativa)是我國乃至世界最主要的糧食作物之一，地球一半以上人口以稻米為食。由子囊真菌Magnaporthegrisea引起的水稻稻瘟病嚴重危害水稻正常的生長發育，影響稻米產量和品質，稻瘟病爆發年份可造成10%～30%的產量損失，嚴重時甚至絕收[1，2]。目前，防治稻瘟病的主要途徑是化學防治和種植抗病水稻品種，但化學防治成本較高且不環保，培育和推廣抗瘟水稻新品種是降低稻瘟病危害的上策[3，4]。稻瘟病抗性屬典型的質量—數量性狀，利用已克隆或精細定位的主效抗性基因，開發高效分子標記進行輔助選擇，能最大限度地提高稻瘟病抗性育種的效率[5，6]。Pi9是一個廣譜持久抗稻瘟病基因，來源于小粒野生稻(Oryzaminuta)，經遠緣雜交導入到秈稻品系75-1-127，被定位在水稻第6號染色體的Pi2/9位點且被成功克隆[7，8]。本研究以75-1-127為Pi9基因供體親本，以高感稻瘟病的優質常規晚稻品種湘晚秈11號為受體親本及輪回親本，利用Pi9基因特異高效分子標記，開展標記輔助選擇育種實踐，改良湘晚秈11號的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料：Pi9基因供體親本75-1-127；受體及輪回親本湘晚秈11號；感病對照品系及稻瘟病誘發品種CO39。

稻瘟菌菌株：來自國內外不同稻區的24份稻瘟菌菌株，用于室內人工接種。

1.2 稻瘟病抗性表型鑒定及抗菌譜分析

室內接種抗性鑒定和抗菌譜分析：將水稻材料75-1-127、湘晚秈11號、CO39播種于育秧基質，26～28 ℃生長至4葉期，用0.2‰的 Tween 20水溶液將稻瘟菌菌株分生孢子配成濃度約1×105個/mL的懸浮液，活體噴霧接種；接種后用黑布覆蓋，于26 ℃、相對濕度>90%條件下培養24 h后，繼續在同溫濕度、12 h光照下誘導發病5～7 d；當CO39葉片出現明顯病斑時觀察統計各材料抗性表型，參照文獻[9]中苗瘟調查分級標準，將0～2級劃分為抗病類型，3～5級劃分為感病類型，并計算各供試材料對不同菌株的抗性頻率(抗性頻率=接種后不致病菌株數÷接種總菌株數×100%)。

田間病圃抗性鑒定：5月中旬將供試水稻材料和誘發品種CO39浸種催芽后播于湖南瀏陽大圍山自然病圃。6月中旬鑒定苗瘟抗性表型，9月中旬鑒定穗瘟抗性表型。

1.3 高效分子標記鑒定與基因型分析

利用課題組已開發的Pi9基因內的功能標記Ins2-1(引物序列為Forward：5′-AACTGTTTTAAACACTCGGGTGGATA-3′；Reverse：5′-CACGATGATAACTTGGGCTAGGGCG-3′)[10]，分析75-1-127與湘晚秈11號之間的多態性，并將其用于標記輔助選擇育種實踐中基因型的鑒定。抽穗前取水稻葉片約0.2 g于2.0 mL 滅菌離心管中，加入液氮研磨成粉末狀，采用CATB法[11]提取總DNA；利用標記引物對各樣品DNA進行PCR擴增；擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后分析標記基因型。10 μL PCR反應體系組成：DNA模板1.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10×Buffer 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃延伸3 min；16 ℃保存。

1.4 回交自交育種群體構建

用湘晚秈11號作母本，75-1-127作父本，雜交獲得F1代；用湘晚秈11號作輪回親本，在長沙和三亞兩地連續回交直至獲得BC6F1代，自交兩代獲得BC6F3群體。回交群體構建具體方法：自BC1F1代起，每世代田間種植約60株，取單株葉片做標記基因型分析，選農藝性狀與受體親本接近的陽性單株回交，混合收種，獲得下一世代。

2 結果與分析

2.1 供試水稻材料的稻瘟病抗性表現及抗菌譜

根據室內接種結果(表1)，75-1-127除了對湘2007A-7、ROR1這2份菌株感病外，其余均為抗病，抗性頻率為91.7%；湘晚秈11號對24份稻瘟菌菌株中的7份表現為抗病，其余17份均為感病，抗性頻率為29.2%；感病對照CO39對所有菌株均表現感病，抗性頻率為0。由田間病圃抗性鑒定結果(圖1)可以看出：受體親本湘晚秈11號高感苗瘟和穗瘟；而75-1-127高抗苗瘟和穗瘟。湘晚秈11號抗菌譜窄、抗性水平低，其稻瘟病抗性急需改良；75-1-127抗菌譜廣、抗性水平高，Pi9基因具有很好的育種價值。

表1 供試材料對24份稻瘟菌菌株的抗譜比較

圖1 供試水稻材料田間病圃稻瘟病抗性表型

2.2 分子標記Ins2-1在雙親間多態性分析

雙親間多態性分析結果表明，Ins2-1是一個顯性DNA標記，利用該標記引物可從75-1-127基因組中擴增出1條532 bp的清晰條帶，而在湘晚秈11號基因組中無擴增產物(圖2A)。并且該標記PCR產物可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，操作簡單快速且成本較低。

2.3 湘晚秈11號改良抗病株系的選育

利用Ins2-1標記，從湘晚秈11號×75-1-127的BC1F1代起，開展分子標記輔助選擇育種實踐，于2016年獲得BC6F1群體，2018年篩選出11個BC6F3株系，2019年經標記基因型分析和田間病圃稻瘟病抗性鑒定，遴選出9個高抗稻瘟病的改良株系湘晚秈11號-Pi9(圖2)，為進一步培育優異抗病優質水稻新品種奠定了基礎。

圖2 抗病改良株系湘晚秈11 號-Pi9的鑒定

3 討論

水稻稻瘟病抗性屬于典型的質量—數量性狀，抗性表型既受遺傳(基因)控制，又受病原菌、溫度、濕度、光照等環境因素影響，因此傳統育種的表型選擇往往不準確、效率低。分子標記輔助選擇育種是對標記基因型的鑒定和選擇，不受環境因素影響，相對于傳統育種更準確高效，現已被廣泛應用于作物遺傳改良，尤其是稻瘟病抗性育種。本研究鑒定出的顯性標記Ins2-1，可以在供體親本75-1-127與受體親本湘晚秈11號間產生明顯而穩定的多態性，選擇效率高，其擴增產物可用瓊脂糖凝膠電泳檢測，成本低、效率高，具有較好的應用前景。廣譜持久抗稻瘟病基因Pi9被成功克隆后，已被廣泛應用于水稻育種實踐。如廖花等[12]利用Pi9基因序列開發出共顯性標記SPL-1，通過分子標記輔助選擇，將Pi9基因導入秈稻恢復系R747 中，培育出了與受體親本遺傳背景高度相似的高抗稻瘟病新品系R747-Pi9，雜交種的稻瘟病抗性也同時改良；李永聰等[13]通過顯性標記Ins1-1的輔助選擇，成功改良了秈稻恢復系R389及其雜交種的稻瘟病抗性；鄒俊鋒等[14]利用共顯性標記Ins2-3改良了秈稻恢復系E32及其雜交種的稻瘟病抗性；殷得所等[15]通過Pi9基因緊密連鎖的共顯性STS標記的輔助選擇育種，成功改良了揚稻6號、R6547及其雜交種的稻瘟病抗性。

本研究獲得的9個含Pi9基因的湘晚秈11號改良抗病系，將用于進一步的農藝、產量、米質等性狀分析，以及不同生態區稻瘟病抗性鑒定，可望最終培育出高產優質抗瘟水稻新品種。