脂肪干細胞及其外泌體減輕肝細胞凋亡改善大鼠肝纖維化

游茂春,劉廣益,程 俊,李雅娟,余 鴻,王巧稚*

(1.西南醫科大學 基礎醫學院組胚教研室,四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學 心血管研究所,四川 瀘州 646000)

肝纖維化是各種慢性肝病發展到肝硬化或肝癌的必經階段,目前臨床針對晚期肝硬化患者肝移植供肝來源缺乏,手術風險大,術后排斥反應大等問題一直存在,改善肝纖維化成為亟待攻克的熱點[1]。 外泌體(Exosomes)是細胞旁分泌的主要形式之一[2],是目前無細胞療法的一大關注點,它是一種由細胞分泌的微型細胞外囊泡,其內含細胞內分泌的大量有效成分,如蛋白質、RNA、microRNA等[3]。 近年來已有研究者利用干細胞分泌的外泌體對實驗動物肝損傷進行研究,發現其可以通過抑制星狀細胞激活和上皮-間質轉化(EMT)等方面對肝損傷修復、炎癥治愈等方面起到一定的效果[4]。脂肪干細胞(ADSCs)取材方便,細胞產量大,由它分泌的外泌體已被研究者用于實驗動物心臟、大腦、肺、腎、皮膚等多方面的研究[5-6],對于肝纖維化的研究目前研究者主要采用基因編輯過的外泌體進行治療[7-8]。 本實驗旨在探究脂肪干細胞直接衍生的外泌體是否具有肝纖維化保護作用并探究其相關機制,為臨床治療肝纖維化提供思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5 只SPF 級10 日齡體重約20～25 g 雄性SD 乳大鼠購買自西南醫科大學實驗動物中心[SCXK(川)2018-17]。 另50 只8 周齡、健康雄性SD 大鼠,體重200 ～220 g,無特定病原體(SPF)級,購自成都達碩實驗動物有限公司[SCXK(川)2015-030]。 大鼠取材和相關實驗于西南醫科大學實驗動物中心實驗室內進行[SYXK(川)2018-065]。 動物實驗過程中,嚴格按照3R 原則給予人道主義關懷,通過西南醫科大學動物實驗倫理審查(201808-55)。

1.2 主要試劑與儀器

I 型膠原酶(C8140)、鏈青霉素雙抗(P1400)、RIPA 裂解液(R0010)均購自索萊寶公司；胰蛋白酶(C0201)、蛋白BCA 濃度測定試劑盒(P0010S)均購自碧云天生物公司；胎牛血清購自以色列BI 公司(04-001-1 A)；無外泌體血清(180625-001)購自美 國 SBI 公 司； DMEM/F12 細 胞 培 養 基(SH30023.01B) 購 自 海 克 龍 公 司； 四 氯 化 碳(C805329-4 L)、橄欖油(O108685)均購自阿拉丁試劑；脂肪干細胞成脂誘導分化試劑盒(RASMD-90031)和成骨誘導分化試劑盒(RASMD-90021)購自賽業生物；α-sma 抗體(ab124964) 購自英國Abcam 公司；actin 抗體(66009-1-Ig)、TGF-β1 抗體(21898-1-AP)、山羊抗兔(SA00001-2)和山羊抗小鼠(SA00001-1)均購自美國Proteintech；Bax 抗體(2772S)、Caspase3(9662S)抗體購自美國CST 公司；BcL-2 抗體(abs115024)購自愛必信生物。 二氧化碳細胞培養箱日本松下電器；倒置相差顯微鏡日本OLYMPUS；超速離心機美國貝克曼公司；石蠟切片機德國徠卡公司；電泳儀美國BIO-RAD 公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪干細胞原代培養及鑒定

取5 只10 日齡SD 乳大鼠放入-20℃冰箱低溫麻醉[9]10 min 后脫頸處死,放入75%乙醇浸泡5 ～10 min,再放入超凈工作臺。 取腹股溝區脂肪組織,PBS 漂洗3 次,去除多余的筋膜和血管,剪成肉糜狀移入無菌離心管。 加入3 倍體積的0.1% I 型膠原酶37℃溫浴,每隔5 min 震蕩一次,消化約30 ～60 min,1200 r/min 離心4 min,棄上清,用配好的完全培養基重懸沉淀,移入無菌培養瓶放入37℃,5%二氧化碳培養箱中培養并進行傳代,取第3 代細胞按照試劑盒說明書進行成脂和成骨分化鑒定。

1.3.2 脂肪干細胞外泌體提取和鑒定

外泌體提取方法參照文獻[10]進行:將第3 ～6代脂肪干細胞培養至50%～60%,更換無外泌體血清配制的完全培養基培養24 ～48 h,直到細胞鋪滿瓶底收集培養上清液。 將培養上清液經1200 r/min離心10 min,留取上清液, 繼續以2000 r/min 離心30 min,留取上清液,再以20000 r/min 離心70 min,棄上清,加入PBS 重懸后,繼續以20000 r/min 離心70 min,此時收集的沉淀即包含外泌體。 BCA 蛋白濃度測試法測定外泌體蛋白濃度,另將收集的一部分外泌體樣本干冰運送至上海歐易生物公司進行透射電鏡檢測、粒徑分析和Western blot 檢測標記蛋白CD81 等進行鑒定。

1.3.3 肝纖維化模型的建立及分組

50 只SD 大鼠適應性飼養一周后,除空白組(10只)注射橄欖油外,其余40 只用30%四氯化碳+橄欖油混合溶液,2 mL/kg 腹腔注射,2 次/周,建模共10 周。 隨機處死10 只大鼠,驗證建模已成功。 剩余30 只大鼠隨機分為: ADSCs 組、Exosomes 組和模型組(每組10 只),分別經尾靜脈注射脂肪干細胞每毫升約1×106個、脂肪干細胞衍生的外泌體約325 μg/mL,均用無菌生理鹽水稀釋至1 mL,模型組和空白組注射1 mL 生理鹽水,所有大鼠第12 周末采用戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔注射麻醉后,生理鹽水灌注取材。 一半肝組織修剪成小塊后4%多聚甲醛浸泡48 h,再移入70%室溫乙醇長期保存,另一半新鮮肝組織修剪成小塊后立即裝進RNase-free 的凍存管,放入液氮罐長期保存。

1.3.4 病理組織切片染色

HE 染色:將大鼠麻醉后進行生理鹽水心臟灌注,取下一半肝組織4%多聚甲醛固定48 h,梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋,制成5 μm 厚度切片。 分別行常規HE 染色:梯度酒精脫蠟復水,放入蘇木精染色中浸泡5 min,自來水沖洗5 min,1%鹽酸乙醇分化褪色數秒,再放入1%氨水返藍數秒。 80%、90%乙醇脫水2 min,再放入90%伊紅乙醇染色5 min,95%、100%、100%乙醇繼續脫水,晾干后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明10 ～20 min,封片,鏡檢。天狼星紅染色:切片復水后,滴加天狼星紅染液染色1 h,自來水沖洗15 min,滴加蘇木精復染細胞核,其余步驟同前。

1.3.5 肝纖維化Ishak 評分

根據《Ishak 肝纖維化分期半定量評估系統》[11]對肝組織HE 染色和天狼星紅染色切片進行評分。

1.3.6 血清肝功AST、ALT 檢測

將采集的血液室溫靜置4 h 后,4000 r/min 離心5 min 吸取上層清澈血清,自動生化分析儀檢測。

1.3.7 Western blot 檢 測Bax、BcL-2、Caspase3、TGF-β1 蛋白表達情況

取大鼠新鮮肝組織約20 mg,液氮研磨,加入200 μL 的裂解液(含蛋白酶、磷酸酶抑制劑)錘打混勻,冰上靜置20 min,12000 r/min 4℃離心20 min,小心吸取上清液,吸取10 μL 作為BCA 蛋白濃度測定,其余蛋白加入1/4 體積的5×上樣緩沖液煮沸5 min,并進行SDS-PAGE 凝膠電泳。 配制10%和15%的分離膠,上樣量約20 μg,電泳分離結束后用PVDF 膜濕法轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,孵育一抗Bax(1 ∶1000)、BcL-2(1 ∶1000)、Caspase3(1 ∶1000)、TGF-β1(1 ∶600)4℃冰箱過夜,以β-actin(1 ∶5000)作為內參。 次日回收一抗,TBST 洗膜3×5 min 后室溫孵育二抗(1 ∶3000)1 h,TBST 洗膜3×5 min,將膜放入ECL 顯影液中浸泡2 min 掃描圖像并用Image J 圖像分析軟件做半定量分析,測定各組肝組織中蛋白質相對表達水平。

1.3.8 免疫組化檢測α-sma 的表達

5 μm 厚度石蠟切片,梯度酒精脫蠟復水,PBS漂洗3×5 min,3%雙氧水室溫靜置10 min,PBS 漂洗3×5 min；將切片放入枸櫞酸鈉緩沖液95℃加熱20 min 進行抗原修復,冷卻至室溫后漂洗3×5 min；滴加10%山羊血清封閉1 h,再滴加一抗α-sma(1 ∶200),4℃濕盒過夜。 次日吸棄一抗PBS 漂洗3×5 min,滴加HRP 標記的二抗,DAB 顯色,自來水沖洗10 min,蘇木精復染,脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統計學方法

數據用SPSS 17.0 統計軟件包進行分析,經正態性檢驗和方差齊性檢驗,再進行獨立樣本均數的t檢驗和單因素方差分析,檢驗水準α = 0.05。Western blot 蛋白表達情況和α-sma 平均陽性表達面積(APSAP)利用Image J 圖像分析軟件進行計算。 統計圖采用GraphPad Prism 8 軟件進行繪制。

2 結果

2.1 脂肪干細胞及脂肪干細胞衍生的外泌體

SD 大鼠原代脂肪干細胞呈長梭形,典型成纖維樣細胞,漩渦狀或魚群狀生長,見圖1A。 細胞培養上清液經超速離心法提取的外泌體粒徑約為160 nm,電鏡下呈杯托狀,見圖1B,表面標記物CD81 陽性,與國外許多文獻描述一致[12]。

2.2 各組大鼠肝組織病理變化和肝纖維化評分

開腹后可見模型組大鼠腹腔粘連嚴重,肝明顯腫大, 質硬, 肝葉之間粘連 嚴重； ADSCs 組和Exosomes 組肉眼觀區別不大,腹腔粘連程度減輕,肝較正常組稍大,肝葉間仍有粘連,質地較模型組軟。 HE 染色,見圖2,可見空白組肝細胞排列整齊,肝細胞胞質紅染,核大而圓,核仁明顯,呈向心性圍繞中央靜脈,門管區小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管形態正常。 模型組肝細胞排列紊亂,出現廣泛氣球樣變,胞質稀疏溶解呈空白,細胞核固縮,肝血竇庫普弗細胞增多,門管區結締組織增多且延伸至小葉間。 天狼星紅染色,見圖2,空白組僅門管區少量結締組織著色,模型組可見門管區結締組織明顯增生,染色明顯,肝小葉被纖維結締組織分割,形成大小不等的假小葉。 經對應治療后,ADSCs 組僅有少量死亡肝細胞成團分布,小葉間纖維結締組織減少,Exosomes 組基本未發現死亡的肝細胞。 大鼠肝纖維化Ishak 評分,見表1,模型組大鼠肝組織廣泛纖維增生,門管區和門管區、門管區和中心靜脈基本均伴有橋接,甚至2 例出現明顯的假小葉,Ishak 評分均大于3 分以上。 ADSCs 組和Exosomes組大多數門管區有纖維增生,小葉間有纖維隔膜,其中Exosomes 組很少見纖維隔膜,有少量短的纖維隔膜,Ishak 評分均在3 分以內。

圖1 SD 大鼠原代脂肪干細胞形態及其衍生的外泌體形態Note.A,Day 7 of culture of primary adipose stem cells from SD rats.B, Transmission electron microscope (TEM) of adipose stem cellderived exosomes (arrows).Figure 1 Morphology of primary adipose stem cells from SD rats and their derived exosomes

圖2 各組大鼠肝組織形態學改變Note.Macroscopic and histopathological changes in rat liver tissue after 2 weeks of treatment.Black arrows indicate areas of hepatocyte death.in the Model group these areas are distributed in large patches, and in the ADSC group they are distributed in patches or spots.blue arrows indicate the central vein.Figure 2 Histopathological changes in the liver in each group

2.3 各組大鼠血清轉氨酶活性的變化

如圖3 所示,治療后第二周末采血檢測血清轉氨酶水平發現,空白組谷草轉氨酶ALT 和谷丙轉氨酶AST 均在正常范圍內,模型組ALT 和AST 水平與空白組相比有顯著升高(P ＜0.001),ADSCs 組與Exosomes 組與模型組均顯著降低(均P＜0.05),其中AST 水平在Exosomes 組(P＜0.05)降低更明顯,ALT 水平兩組差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 免疫組化檢測α-sma 表達變化

α-sma 是肝星狀細胞活化的標志性蛋白,也是纖維化的標志之一,免疫組織化學檢測發現,見圖4A,空白組α-sma 僅少量表達于肝門管區,模型組除了門管區表達顯著增強外假小葉周邊區域也強表達,ADSC 組和Exosomes 組表達明顯較模型組減弱。 利用Image J 圖像分析軟件計算各組α-sma 平均陽性表達面積(APSAP)發現,模型組面積較空白組顯著增加,ADSCs 組(P＜0.01)和Exosomes 組(P＜0.05)表達面積較模型組明顯變小,兩者之間差異無統計學意義(P＞0.05)(見圖4B)。

2.5 各組大鼠蛋白表達變化

Western blot 實驗發現,見圖5,TGF-β1 既可以作為纖維化的標志之一,也可以視作肝細胞死亡的標記蛋白,模型組TGF-β1 表達明顯高于空白組、ADSCs 組和Exosomes 組,均(P＜0.001),與模型鑒定組沒有明顯差異(P＞0.05),促凋亡蛋白Bax(P＜0.001)和凋亡執行蛋白Caspase3 較空白組明顯增高(P ＜0.001),與模型鑒定組無明顯差異(P ＞0.05),抑凋亡因子BcL-2 表達較空白組明顯降低(P＜0.001),較模型鑒定組明顯上調(P＜0.05)。 與模型組相比,ADSCs 組和Exosomes 組TGF-β1、Bax和Caspase3 表達均有明顯下調,抑凋亡因子BcL-2表達ADSCs 組和Exosomes 組較模型組均有明顯升高(均P ＜0.001),以上指標兩組間差異無統計學意義。

表1 各組大鼠肝纖維化Ishak 評分(n=10)Table 1 Ishak score of rats liver fibrosis in each group

圖3 血清AST 和ALT 水平比較Note.The automatic biochemical analyzer measures the serum AST and ALT levels in each group.The normal group indicates the olive oil injection group, the model group indicates the saline injection group after the model is established.Compared with the Control group, ***P＜0.001.Compared with the Exosomes group and ADSCs group,***P＜0.001.The serum level of AST in Model group compared with the Control group, ***P＜0.001.Compared with the Exosomes group, *** P＜0.001.Compared with the ADSCs group, *P＜0.05.The serum level of ALT in Exosome group and ADSCs group were no significance,P＞0.05 (n.s).The serum level of AST in Exosomes group compared with ADSCs group, *P＜0.05.Figure 3 Comparison of AST and ALT in serum

圖4 免疫組化檢測α-sma 的表達Note.A, immunohistochemical analysis of α-sma expression in liver tissues of each group, and the brown-yellow region in the figure was the region with positive expression of α-sma (Light microscope).B,α-sma positive expression area percentage.Compared with the Exosomes group, **P ＜0.01.Compared with the ADSCs group, *P＜0.05, between the Exosomes group and the ADSCs group, P＞0.05 (n.s).Figure 4 Expression of α-sma detected by immunohistochemical staining

圖5 各組大鼠凋亡相關蛋白表達水平檢測Note.Western blot was used to detect the expression of related proteins.Model identification indicates that the material was taken during model identification.The expression of TGF-β1/Bax/BcL-2 in Model group compared with the Control group, ***P ＜0.001.Compared with the Exsomes group and ADSCs group, ***P＜0.001.The expression of Caspase3 compared with the Control group, ***P＜0.001.Compared with the Exsomes group, **P＜0.01.Compared with the ADSCs group,*P＜0.05.Figure 5 Expression levels of apoptosis-related proteins in rats were measured

3 討論

肝纖維化是指當肝受到不同類型理化因素的影響,引起肝細胞死亡或者炎癥刺激,肝細胞、肝星狀細胞(HSC)、枯否細胞、肝血竇內皮細胞等出現異常誘導產生大量細胞外基質,超出肝降解能力形成纖維沉積,肝修復能力超負荷發生纖維化甚至硬化。 前期已有很多實驗證明包括脂肪干細胞在內各種類型的干細胞在大鼠急性和慢性肝損傷方面都能起到修復損傷、改善肝功能的療效[13-15],但干細胞移植有一定的成瘤性、靶向性差、存活率不高等問題尚未完全解決[16-17]。 研究表明外泌體的旁分泌作用主要通過將內含物轉運至靶細胞所在位置,通過與靶細胞膜上的受體結合或者直接與靶細胞膜融合釋放活性成分,調控靶細胞的功能,相較于干細胞,外泌體具有免疫原性更低、能自由進出細胞、保存方便、方便大規模提取等優點,更不存在無法穿越血管床等缺點,使其在無細胞治療領域具有非常大的潛力[18]。 本實驗采用無外泌體血清配制培養基,從脂肪干細胞上清液中分離出外泌體,推測外泌體也可以改善大鼠肝纖維化。

本實驗采用經典的四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型,建模10 周后,通過HE 染色和天狼星紅染色發現模型組大鼠肝細胞出現大片狀壞死,門管區纖維結締組織顯著增生,常伴纖維橋連,Ishak 肝纖維化評分60%大鼠均在4 分以上,血清生化轉氨酶明顯增高,表示建模成功。 經脂肪干細胞和它分泌的外泌體治療后,血清轉氨酶下降、病理切片顯示纖維結締組織減少,Ishak 肝纖維化評分大都降至1～2 分,肝細胞壞死相關因子TGF-β1 以及HSC 活化標記物α-sma(同時也可以作為纖維化標記物)的表達經治療后均得到下調,說明脂肪干細胞及其分泌的外泌體均能夠逆轉肝細胞死亡并且抑制肝星狀細胞活化,從而減輕肝纖維化程度。 模型組相較于模型鑒定時的BcL-2 表達稍微上調,其余指標無顯著差異,可以認為四氯化碳誘導的大鼠慢性肝纖維化模型具有一定程度的自愈能力,與以往的研究結果一致[19],在本實驗中未對結果造成明顯影響。

目前公認HSC 活化是肝纖維化的關鍵環節,相關研究已經非常多[20-21],而肝細胞死亡才是肝纖維化的始動環節。 肝細胞死亡分為壞死和凋亡,它們在機制和表現上都是不同的,但是在肝病理上壞死和凋亡往往結伴而行。 它們有共同的致病機制,通過不同的途徑都能導致肝發生不可逆的損傷[22]。大量研究表明[23-24],肝細胞凋亡與肝纖維化密切相關,凋亡細胞的DNA 片段可以激活HSC 轉分化為肌成纖維細胞(MFB),MFB 分泌大量細胞外基質；吞噬了凋亡小體的枯否細胞誘導促炎癥因子和促纖因子產生如TNF-α、TGF-β1 等。 同時,一些凋亡小體會自行裂解,釋放后加重肝炎癥。 隨著病情進展肝血竇內皮出現毛細血管化,導致肝細胞缺血缺氧,進一步加重肝細胞死亡。 理論上若能夠干預肝細胞凋亡途徑就可以改善纖維化。

本實驗通過檢測肝組織蛋白檢測促凋亡因子Bax 和下游凋亡執行蛋白Caspase3 以及抑凋亡因子BcL-2 的表達,發現ADSCs 組和Exosomes 組Bax 和Caspase3 明顯低于模型組,而BcL-2 的表達明顯高于模型對照組。 可以推斷,四氯化碳導致的脂質過氧化導致肝細胞線粒體通透性增高,激活線粒體凋亡途徑中BcL-2 家族中促凋亡基因Bax、Bad、Bim、Bad 等,它們在接收到死亡信號后轉移到線粒體中,促進細胞色素C 的釋放,放大死亡受體信號,激活下游Caspase3 導致細胞凋亡[25]。 然而該家族內BcL-2、Bcl-XL、Bcl-W、McL-1 等可以通過降低線粒體膜的通透性,減少細胞色素C 的釋放,抑制內質網膜上鈣離子的流動性,減少氧自由基生成和脂質過氧化物的形成,從而達到抗凋亡的作用[26-27]。

綜上所述,脂肪干細胞以及外泌體移植都可以逆轉細胞凋亡途徑,減輕肝細胞受損程度,從而減少肝星狀細胞的激活,改善肝纖維化。 然而脂肪干細胞外泌體中到底是什么因子或者其他生物活性成分在本實驗中起主要作用,擬下一步通過對外泌體做蛋白質組學檢測或microRNA 測序篩查特異性因子,進一步探索和驗證。