慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)對(duì)自身免疫性心肌炎大鼠Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡的影響

張晶晶,劉 婕,楊占峰,孫 巖,岳麗曉,何群力

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,河南 新鄭 451100)

自身免疫性心肌炎是一種由T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,多項(xiàng)研究均顯示,Th1/Th2 細(xì)胞漂移和Th17/Treg 細(xì)胞平衡與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[1-3]。Th1 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17,而Th2 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞主要分泌抑炎細(xì)胞因子IL-4 和TGF-β[4]。 當(dāng)T 細(xì)胞亞群從Th1 向Th2 漂移或Th17 細(xì)胞減少而Treg 細(xì)胞增加時(shí),則表明機(jī)體炎癥反應(yīng)被抑制,反之能表明炎癥反應(yīng)加劇。 Fg12 凝血酶原酶是一種II 型跨膜糖蛋白,其在免疫調(diào)節(jié)和凝血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 目前,Fg12基因的研究主要集中在肝病方面,多項(xiàng)研究均報(bào)道Fg12 蛋白具有促炎作用,由于自身免疫性心肌炎的病理過(guò)程與炎癥反應(yīng)和纖維化密切相關(guān),因此,本研究推測(cè)Fg12 基因可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本研究通過(guò)建立自身免疫性心肌炎大鼠模型,應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)敲低大鼠Fg12 基因,旨在探討Fg12 基因表達(dá)與Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡之間的關(guān)聯(lián),以期為自身免疫性心肌炎的治療提高理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡Sprague Dawley(SD)雄性SPF 大鼠購(gòu)自凱學(xué)生物科技(上海)有限公司[SCXK(滬)2018-0006],體重為200～220 g,共40 只。 動(dòng)物購(gòu)回后在鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)[SYXK(豫)2019-0011]。 大鼠在25℃、55%相對(duì)濕度、12 h 光暗循環(huán)的環(huán)境中,給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水飼養(yǎng)。 本研究已獲得我院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(ZZGYXY-20190314)。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒Fgl2 載體以及攜帶綠色熒光蛋白慢病毒空載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司進(jìn)行合成；MAC 1200ST 心電分析儀和GE logic E9 心臟超聲診斷儀均由美國(guó)GE Marquette 醫(yī)療系統(tǒng)公司生產(chǎn)；完全弗氏佐劑和豬心肌球蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司； PrimeScript RT reagent 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq 購(gòu)自日本TaKaRa 公司；快速7500 型熒光定量PCR 儀和TaqMan MicroRNA 測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒P1250購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；IFN-γ、IL-17和TGF-β 一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；IL-4、TGF-β 和β-actin 一抗購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分為4 組,即對(duì)照組(NC 組)、模型組(Model 組)、空載組(Vehicle 組)、Fgl2-RNAi 慢病毒組(RNAi 組),每組10 只。

1.3.2 自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立

參考文獻(xiàn)[7]所述方法進(jìn)行自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立。 將豬心肌球蛋白加入0.15 mol/L的PBS 溶液中進(jìn)行溶解,終濃度調(diào)整為2 mg/mL。豬心肌球蛋白溶液與完全弗氏佐劑進(jìn)行等體積混合,得到乳濁液。 在模型組、空載組和Fgl2-RNAi 慢病毒組SD 大鼠雙側(cè)腹股溝處注射豬心肌球蛋白乳濁液1 mL,即2 mg。 此外,將等體積的PBS 與完全弗氏佐劑混合,在對(duì)照組大鼠相同部位進(jìn)行注射。所有大鼠共注射7 d 進(jìn)行免疫。

1.3.3 Fgl2-RNAi 慢病毒處理

慢病毒Fgl2 載體以及攜帶綠色熒光蛋白慢病毒空載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司進(jìn)行合成。 將包裝好的Fgl2-RNAi 慢病毒1 mL 加入到生理鹽水中溶解混勻,制備終體積為200 μL/mL 的慢病毒混合液。 將攜帶綠色熒光蛋白的空載體慢病毒1 mL加入到生理鹽水中進(jìn)行溶解混勻,制備終體積為200 μL/mL 的慢病毒空載體混合液。 然后對(duì)Fgl2-RNAi 慢病毒組大鼠尾靜脈注射0.5 mL 的混合液,其中含有100 μL 的Fgl2-RNAi 慢病毒。 空載組大鼠注射等體積的慢病毒空載體混合液。

1.3.4 心臟功能監(jiān)測(cè)

MAC 1200ST 心電分析儀和GE logic E9 心臟超聲診斷儀均由美國(guó)GE Marquette 醫(yī)療系統(tǒng)公司生產(chǎn)。 分別于免疫第0 天和第28 天檢測(cè)各組大鼠的心臟功能,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,然后將大鼠仰臥固定在桌面上進(jìn)行胸部脫毛,然后通過(guò)心臟彩超心動(dòng)圖檢測(cè),并獲取左室收縮末期的橫徑(LVEDs)、左室舒張末期的橫徑(LVEDd)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF%)和左室短軸的縮短分?jǐn)?shù)(FS%)等指標(biāo)。

1.3.5 大鼠心肌病理學(xué)檢查

在初次免疫第28 天時(shí)處死大鼠,開(kāi)胸取出心臟,然后沿冠狀面縱切心臟分為兩份。 一份應(yīng)用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,另一份凍存于-80℃冰箱。將4%多聚甲醛固定的心肌組織進(jìn)行梯度乙醇脫水及二甲苯透明,然后石蠟包埋,制作厚度4 μm 的切片。 然后將貼片進(jìn)行常規(guī)HE 染色,主要步驟包括二甲苯脫蠟,每次10 min,然后無(wú)水乙醇洗脫二甲苯5 min,梯度乙醇進(jìn)行脫水,然后蒸餾水洗片5 min,蘇木素染色5 min,在用蒸餾水洗片,依次在1%的鹽酸和碳酸鋰中浸泡3 s,之后用蒸餾水洗滌10 min。 然后用伊紅染色5 min,梯度乙醇脫水,然后二甲苯浸潤(rùn)2 次,室溫干燥并封片。 在光學(xué)顯微鏡先觀察切片,隨機(jī)選取5 個(gè)視野并計(jì)算炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死面積占整個(gè)視野的百分比,然后對(duì)心肌炎癥進(jìn)行評(píng)分。 評(píng)分如下:＜25%為1 分,25 ～50%為2分,51～75%為3 分,＞75%為4 分。

1.3.6 qRT-PCR

使用TRIzol 試劑提取大鼠組織的總RNA。 使用PrimeScript RT reagent 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA為cDNA,并使用TaqMan MicroRNA 測(cè)定試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 定量,總反應(yīng)體積為20 μL。 使用SYBR Premix Ex Taq 在ABI Prism 快速7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR 分析,甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。 引物序列如下:Fg12,正向:5’-GATGGCTGGACGCGGTTAAAGGG-3’； 反 向:5’-TAATGTGGTGGTTAGGGGTGGT-3’；IFN-γ,正向:5’-GACTTTGGCAAAAGGTGGG-3’；反向:5’-TGGGGAATGTTGGTAGGT-3’；IL-17,正向:5’-CAGTTTGGTGGAAGGAGGCGA-3’； 反 向: 5’-TGCGGGAGTGGGCGGATGAGGT-3’；IL-4,正向:5’-CAGGGTTGAGGAGTTAAGGCGA-3’； 反 向: 5 ’-TGTGGGAGTACGGATGGGT-3’；TGF-β,正 向:5’-AGGTAAGTTAATGGTGGTGCGAC-3’； 反 向: 5’-TGTGGGAATGGGCGTGGAGTAGGT-3’；GAPDH,正向:5’-CCAGGTCAAGCTGCGAGAAC-3’；反向5’-TAAGACGCCAGTCGGGTGTGGA-3’。 PCR 反 應(yīng) 條件如下,95℃3 min 預(yù)變性,95℃30 s 變性,60℃30 s退火,72℃30 s 延伸,30 個(gè)循環(huán), 72℃5 min 延伸。 使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 Western blot

使用組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒P1250 提取大鼠心肌組織總蛋白。 應(yīng)用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量,然后將蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行10%SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,室溫下在5%脫脂乳中封閉30 min,然后與抗IFN-γ (1 ∶2000)、IL-17 (1 ∶1500)、IL-4 (1 ∶2000)、TGF-β (1 ∶1000)和βactin (1 ∶1000)的一抗4℃過(guò)夜孵育,然后在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,使用Image 軟件分析蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()。 通過(guò)單因素方差分析評(píng)估組間差異,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)下調(diào)了大鼠心肌組織中Fg12 基因的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果證實(shí)(圖1),與對(duì)照組(NC)相比,模型組(Model)和空載體組(Vehicle)的Fg12 mRNA 表達(dá)水平顯著升高,然而Fgl2-RNAi 慢病毒處理組(RNAi)的Fg12 mRNA 表達(dá)水平顯著低于模型組和空載體組。 表明慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)下調(diào)了大鼠心肌組織中Fg12 基因的表達(dá)。

2.2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較

表1 顯示,各組大鼠的基線超聲心動(dòng)圖參數(shù)LVEDs、LVEDd、LVEF 和FS 均無(wú)顯著差異,在建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEDs 和LVEDd 均顯著升高,并且RNAi 組顯著低于Model組。 此外,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEF和FS 均顯著降低,而RNAi 組顯著高于Model 組。

2.3 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果

建模28 d 后,發(fā)現(xiàn)Model 組、Vehicle 組和RNAi組大鼠的心肌組織中均出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹或壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管擴(kuò)張等,而NC 組未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。但RNAi 組大鼠心肌組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度低于Model 組。 炎癥評(píng)分顯示,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的炎癥評(píng)分均顯著高于NC 組,而RNAi 組的炎癥評(píng)分明顯低于Model 組。 詳見(jiàn)圖2。

2.4 Fg12 基因沉默對(duì)自身免疫性心肌炎大鼠Th1/Th2 漂移的影響

圖1 各組大鼠心肌組織Fg12 基因的表達(dá)Note.Compared with NC group, *P ＜0.05.Compared with Model group, #P ＜0.05.Figure 1 Expression of the Fg12 gene in myocardial tissue of rats in each group

Th1 細(xì)胞可分泌促炎細(xì)胞因子IFN-γ,Th2 細(xì)胞可分泌抑炎細(xì)胞因子IL-4。 如圖3 所示,建模28 d后, Model 組、Vehicle 組和RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ 和IL-4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯示升高,說(shuō)明三組大鼠心肌組織均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 然而,值得注意的是,RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Model組,而IL-4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著高于Model 組。 說(shuō)明Fg12 基因沉默導(dǎo)致大鼠心肌組織中的輔助性T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞漂移,從而降低炎癥反應(yīng)。

2.5 Fg12 基因沉默對(duì)自身免疫性心肌炎大鼠Th17/Treg 平衡的影響

促炎細(xì)胞因子IL-17 主要由Th17 細(xì)胞分泌,而抑炎細(xì)胞因子TGF-β 主要由Treg 細(xì)胞分泌。 如圖4 所示,建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi組大鼠心肌組織中的IL-17 和TGF-β mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯示升高。 然而,RNAi 組大鼠心肌組織中的IL-17 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Model 組,而TGF-β mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著高于Model 組。 說(shuō)明Fg12 基因沉默可抑制大鼠心肌組織中的Th17 細(xì)胞,而上調(diào)Treg 細(xì)胞,從而抑制炎癥反應(yīng)。

3 討論

心肌炎是一種在青少年人群中較為常見(jiàn)的一種心血管疾病,主要致病原因?yàn)椴《靖腥尽?心肌炎與其他心血管疾病的癥狀比較類似,因此臨床診斷中也比較困難[8]。 目前,心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,許多專家認(rèn)為心肌炎與病毒感染引起的心肌抗原自身免疫反應(yīng)有關(guān)。 因此,目前的大多數(shù)病理研究著重于自身免疫性心肌炎的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn),該模型主要通過(guò)心肌球蛋白誘導(dǎo)動(dòng)物心肌損傷及多核細(xì)胞浸潤(rùn),其發(fā)病機(jī)制與病毒性心肌炎和人類巨細(xì)胞心肌炎類似[9]。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)Table 1 Echocardiographic parameters of rats in each group

圖2 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果Note.a, HE staining legend.b, HE staining inflammation score.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 2 Results of HE staining of myocardial tissue in each group

圖3 Fg12 基因沉默對(duì)Th1/Th2 漂移的影響Note.a and b, Relative expression of IFN-γ and IL-4 mRNA in myocardial tissue of each group.c and d, Relative expression of IFN-γ and IL-4 protein in myocardial tissue of each group.e, IFN-γ and IL-4 protein bands.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 3 Effect of Fg12 gene silencing on Th1/Th2 drift

圖4 Fg12 基因沉默對(duì)Th17/Treg 平衡的影響Note.a and b, Relative expression of IL-17 and TGF-β mRNA in myocardial tissue of each group.c and d, Relative expression of IL-17 and TGF-β protein in myocardial tissue of each group.e, IL-17 and TGF-β protein bands.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with Model group, #P＜0.05.Figure 4 Effect of Fg12 gene silencing on Th17/Treg balance

Fg12 凝血酶原酶是一種II 型跨膜糖蛋白,屬于纖維蛋白家族,Fg12 蛋白可由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá),在免疫調(diào)節(jié)和凝血過(guò)程中發(fā)揮重要作用,Fg12 可將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶并導(dǎo)致形成不溶性纖維蛋白,從而加速纖維蛋白沉積及形成血栓[10]。 目前,Fg12 基因的研究主要集中在肝病方面,多項(xiàng)研究均報(bào)道Fg12 蛋白具有促炎作用,然而Fg12 基因與自身免疫性心肌炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍不明確[11]。 本研究建立了自身免疫性心肌炎大鼠模型,并應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)Fg12 基因沉默技術(shù)敲低大鼠Fg12 基因,研究顯示,建模28 d 后,Model 組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEDs 和LVEDd 均顯著升高,并且RNAi 組顯著低于Model 組。 此外,Model組、Vehicle 組和RNAi 組的LVEF 和FS 均顯著降低,而RNAi 組顯著高于Model 組。 由于LVEDd 是評(píng)價(jià)左室舒張功能的指標(biāo),而FS 是評(píng)價(jià)收縮功能,LVEDd 升高或FS 下降則說(shuō)明心臟舒張功能發(fā)生障礙[12]。 LVEF 是LVEDs 與LVEDd 的比值,LVEF 下降則說(shuō)明心臟收縮能力發(fā)生障礙[12]。 因此,本研究表明,Fg12 基因沉默可顯著改善自身免疫性心肌炎大鼠的心臟功能。 此外,HE 染色結(jié)果也顯示,Fg12基因沉默可顯著降低大鼠心肌組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而抑制炎癥反應(yīng)。

自身免疫性心肌炎是一種由T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,有關(guān)學(xué)者通常將CD4+T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子分為Th1 和Th2 細(xì)胞,Th1 細(xì)胞因子具有介導(dǎo)細(xì)胞免疫和抗腫瘤免疫作用,比如IFN-γ 和IL-2；而Th2 某些細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫逃逸機(jī)制,如IL-4 和IL-6。。 疾病發(fā)生早期主要分泌Th1 細(xì)胞因子,導(dǎo)致Th1/Th2 漂移。 Th1 和Th2 細(xì)胞因子的紊亂可誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)展。 Th1 和Th2 細(xì)胞因子由機(jī)體T 淋巴細(xì)胞分泌并形成網(wǎng)絡(luò),正常情況下兩種細(xì)胞因子通過(guò)互相影響并維持機(jī)體免疫功能的正常運(yùn)作,IFN-γ 是自身免疫中出現(xiàn)較早的細(xì)胞因子,主要參與調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用,IL-2 是維持機(jī)體正常免疫功能的細(xì)胞因子,具有廣譜的免疫增強(qiáng)活性,IL-4 可抑制Th1 細(xì)胞因子的分泌,IL-6 則具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成的作用。

此外,隨著淋巴細(xì)胞亞群的劃分越來(lái)越細(xì),多項(xiàng)研究均顯示,新的亞群如Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的平衡性也與自身免疫性心肌炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Th17 細(xì)胞分泌的IL-17 細(xì)胞因子在急性病毒性心肌炎患者中顯著升高[13],而且IL-17 也參與調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的分化及Treg 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子TGF-β 的分泌過(guò)程,而包括CD4+CD25+Treg 細(xì)胞在內(nèi)的Treg 細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用[14]。 現(xiàn)有研究均證實(shí),Th1 和Th17 細(xì)胞主要表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng),而Th2 和Treg 細(xì)胞主要表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)[15]。 Th17 和Treg 細(xì)胞之間的平衡影響疾病的進(jìn)展,如果平衡從Treg 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞移動(dòng),即Th17/Treg 細(xì)胞比率升高,則疾病的嚴(yán)重程度會(huì)顯著升高。 Th17 細(xì)胞通過(guò)分泌IL-6 和IL-17 而發(fā)揮促炎作用,而Treg 細(xì)胞通過(guò)分泌TGF-β 和IL-10 在抑制炎癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用[15]。

因此,Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡可反應(yīng)自身免疫性心肌炎的嚴(yán)重程度。 本研究發(fā)現(xiàn),建模28 d 后, Model 組、Vehicle 組和RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ、IL-4、IL-17 和TGF-β mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯示升高,說(shuō)明三組大鼠心肌組織均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。 然而,值得注意的是,RNAi 組大鼠心肌組織中的IFN-γ 和IL-17 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著低于Model 組,而IL-4 和TGF-β mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于Model 組。 說(shuō)明Fg12基因沉默導(dǎo)致大鼠心肌組織中的輔助性T 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞漂移,并且下調(diào)Th17 細(xì)胞,而上調(diào)Treg 細(xì)胞,從而糾正Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 細(xì)胞平衡,并緩解心肌炎癥反應(yīng)。

綜上所述,本研究表明Fg12 基因通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2 漂移及Th17/Treg 平衡來(lái)參與自身免疫性心肌炎的發(fā)生發(fā)展,Fg12 基因沉默可顯著改善自身免疫性心肌炎大鼠的心臟功能,并降低心肌炎癥反應(yīng)。