窒息法致大鼠心臟驟停-心肺復蘇模型造模成功率與生存率影響因素的探討

曾瑞峰,鐘悅嘉,賴成志,賴 芳,劉相圻,段云彪,李尊江,吳炎華,李 俊,丁邦晗*

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院,廣東省中醫院,廣東省中醫急癥研究重點實驗室,廣州 510120；2.廣州中醫藥大學,廣州 510006；3.廣州中醫藥大學深圳醫院,廣東 深圳 518034；4.江門市五邑中醫院,廣東 江門 529000)

心臟驟停(cardiac arrest, CA)是威脅人類生命的重要病因。 目前我國每年約有54.4 萬人發生CA[1],院外心臟驟停(out-of-hospital cardiac arrest,OHCA) 自主循環恢復( return of spontaneous circulation, ROSC)的成功率約為5%,ROSC 后神經功能完好出院的成功率不足1%[2]。 因此深入開展CA 的相關研究,提高CA 患者復蘇成功率有其長遠意義。 但是由于CA 患者基線難以統一,大部分沒有目擊者, 因此心肺復蘇( cardiopulmonary resuscitation, CPR)的臨床研究難以開展[3]。 故通過建立標準化的動物模型來研究CPR 過程中的病理生理變化則顯得尤為重要。 目前,關于優化CPR及了解CA 病理生理的研究多是通過建立動物模型實現[4-5],其中比較經典的是室顫法和窒息法[6]。

窒息法誘導的CA 由于實驗操作相對簡單,更符合心臟驟停后綜合征(post cardiac arrest syndrome, PCAS)的腦損傷機制[7],為國內外研究機構廣泛采用于PCAS 的研究[8-9]。 但是,由于動物來源、實驗條件、研究方案等不同,從而影響了實驗結果的可比性[10]。 此外,建立穩定的窒息法心臟驟停- 心肺復蘇(cardiac arrest-cardiopulmonary resuscitation, CA-CPR)動物模型,需要考慮體重,生理狀況和其他特征的影響[11]。 本研究通過對窒息法大鼠CA-CPR 模型的觀察,探討影響大鼠CACPR 模型ROSC 及存活的可能相關因素,為建立一種穩定的窒息法CA-CPR 大鼠模型提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用動物由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供[SCXK(粵)2018-0034],50 只清潔級Sprague-Dawley(SD)成年雄性大鼠,周齡6～10 周,體重(330±50) g。 本實驗在中山大學心肺腦復蘇研究所進行[SYXK(粵)2013-0094],方案經中山大學實驗動物管理與使用委員會、中山大學動物實驗倫理審查委員會表決批準通過(DB-15-1207),動物處置方法符合動物倫理學標準,并遵循實驗動物的3R 原則,給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(美國Sigma 公司)；氯化琥珀膽堿(西安力邦制藥)； 0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業)；肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫藥)；鹽酸腎上腺素注射液(武漢遠大制藥)；大鼠機械復蘇聯合有創呼吸機裝置(中山大學心肺腦復蘇研究所自主研發)；除顫監護儀(M 系列 卓爾)；多參數生理參數監護儀(雅培)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

本實驗采用前瞻性觀察性研究的分析方法,50只SD 大鼠進入實驗,根據體重與周齡的關系[12],分為Ⅰ(250～300 g)、Ⅱ(300 ～350 g)、Ⅲ組(350 ～400 g)；再根據是否ROSC、是否存活6 h、24 h、72 h 進行亞組分析。 三組放于同一房間以相同飲食飼養,室溫控制在(24±2)℃,濕度(50±5)%,晝夜交替(12 h:12 h)。

1.3.2 造模步驟

(1)動物術前準備及麻醉

大鼠在實驗前一天禁食,不禁水,可自由活動。稱量大鼠重量,用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉,必要時追加劑量。 大鼠常規編號,備皮,仰臥位固定于手術板上。 造模階段,采用電熱毯保暖。經口直視插入14 號氣管鞘管。 左股動脈置入23 號Pe-50 聚乙烯管,近端三通管、壓力傳感器連接多參數生理參數監護儀,以實時監測平均動脈血壓(mean arterial pressure, MAP)。 將相應電極針插入大鼠肢體的皮膚下,持續心率(heartheart rate,HR)、心電監護。

(2)大鼠窒息性CA 的誘導

手術完成后,待大鼠蘇醒記錄基線HR、MAP 和肛溫。 注射氯化琥珀膽堿0.2 mL 誘導大鼠肌松,封堵氣管導管誘導大鼠窒息。 將開始窒息至MAP 降至20 mmHg 以下的時間定義為窒息致心臟停搏(asphyxia -cardiac arrest, ACA)時間。 間歇6 min 后開始心肺復蘇。

(3)復蘇模型制備

利用CPR 裝置進行頻率為250 beat/min 的胸外按壓和50 beat/min 的同步機械通氣。 按壓深度胸廓前后徑的1/3,吸入氧濃度為100%,潮氣量0.6 mL/100 g。 推注腎上腺素0.01 mg,2 min 注射1次。 直至ROSC 或復蘇失敗(CPR 10 min 后仍未ROSC)。 出現室顫,進行2 J 雙向波除顫。

(4)ROSC

MAP≥60 mmHg 后暫停胸外按壓,維持呼吸機通氣；MAP≥60 mmHg 且持續5 min 的室上節律,被認定為ROSC,造模成功。

(5)脫機、拔管及創口縫合

復蘇后繼續機械通氣及持續監測血壓和心率1 h,如果生命體征平穩則可停止機械通氣和拔除各種導管,結扎血管,放入鼠籠內,自由飲食飲水,室溫控制在26℃。

1.3.3 觀察指標

(1)基線資料:記錄手術后誘導窒息前大鼠的MAP、HR 及肛溫,ACA 時間,CA 持續時間,CA 后初始心律(心室停搏、心室顫動、無脈性電活動)；

(2)復蘇資料:大鼠ROSC 成功率、CPR 時間(指心肺復蘇開始計時至ROSC 的時間)；ROSC 后的血流動力學:以ROSC 即刻記為0 min,記錄0 min、15 min、30 min、45 min、60 min 的MAP 和HR。

(3)生存率及神經功能缺損評分(NDS 評分):記錄72 h 內大鼠生存率及6、24、72 h NDS 評分。NDS 評分(0～80 分,0 分腦死亡,80 分完全正常)從大鼠一般行為缺失、腦干功能、運動、感覺、行為、癲癇發作等不同方面評價大鼠腦神經功能[13]。

1.4 統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0 統計軟件包建立數據庫并完成統計。 計量資料符合正態分布的數據以平均數±標準差()表示,不符合正態分布的數據以中位數(四分位數)表示。 兩組間比較,符合正態分布、方差齊的數據采用t 檢驗；不符合正態分布及方差齊性的數據采用Wilcoxon-Mann-Whitney 檢驗。 多組間比較,方差齊采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H 檢驗。 計數資料比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 進行生存分析。 采用二分類Logistic 回歸評估相關指標與分類結果的關系。 檢驗水平α=0.05。

2 結果

2.1 三組大鼠誘導窒息前一般情況

50 只大鼠全部納入窒息造模,大鼠按體重分為Ⅰ組(250～300 g,10 只)、Ⅱ組(300～350 g,30 只)、Ⅲ組(350～400 g,10 只),手術前三組大鼠反應敏捷,體毛光澤,飲食正常。 手術后誘導窒息前三組大鼠的肛溫、MAP、HR、ACA 時間、CA 持續時間、CA初始心律等基線資料比較,差異均無統計學意義(均P ＞0.05),見表1。

2.2 三組大鼠復蘇數據的比較

2.2.1 ROSC 成功率、CPR 時間、除顫次數

Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組CA-CPR 造模成功例數(ROSC例 數) 分 別 為 9 (90.00%)、 18 (60.00%)、 6(60.00%),其中Ⅱ組有1 只大鼠ROSC 維持小于15 min,三組的ROSC 成功率、除顫次數對比無統計學差異(均P ＞0.05)。 Ⅰ組表現出更短的CPR 時間,與Ⅱ組、Ⅲ組比較,均存在統計學差異(P ＜0.05,詳見表2)。

2.2.2 ROSC 后血流動力學

ROSC 后1 h 的血流動力學比較,Ⅰ組大鼠在ROSC 后第30 min 的HR 對比上,與Ⅱ組大鼠存在統計學差異(P ＜0.05),與Ⅲ組大鼠不存在統計學差異(P ＞0.05)；余時間段HR、MAP 比較,三組大鼠均未表現出統計學差異(均P ＞0.05,詳見表3)。

2.3 生存分析

運用Kaplan-Meier 生存分析比較三組的累積生存時間,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的72 h 的生存率分別是55.6%、16.7%和16.7%。 用Log rank法對三組累積生存分布的差異進行檢驗,差異不具有統計學意義,χ2=3.696,P=0.158(參見圖1)。

2.4 NDS 評分

三組大鼠6 h、24 h、72 h 的NDS 評分的分布無統計學差異。 48 h 的NDS 分布不全相同,差異具有統計學意義(H= 6.247, P= 0.044)；采用Bonferroni 法校正顯著性水平的事后兩兩比較發現,48 h NDS 評分的分布在Ⅰ組和Ⅱ組(調整后P=0.051)、Ⅰ組和Ⅲ組(調整后P=0.185)、Ⅰ組和Ⅲ組(調整后P=1.0)的差異無統計學意義(詳見表4)。

2.5 一般情況與模型結局的相關性分析

2.5.1 一般情況與ROSC、存活6 h、24 h、72 h 的單因素分析

經統計發現,ROSC 與存活24 h 的大鼠,具有更長的ACA 時間更長(226.00(195.50,251.50)s 及236.00(195.50,251.50)s)。 存活6 h 與存活72 h的大 鼠 體 重 較 低(分 別(315.64 ± 25.78) g 和(329.41±22.60 g))；存活24 h 與存活72 h 的大鼠,基礎HR 更低(分別(419.93±23.76) 次/分、(417.44±22.88)次/分,(均P ＜0.05)。 基線的肛溫、MAP、CA 持續時間與大鼠的結局無統計學相關性(均P ＞0.05)。

表1 三組大鼠的誘導窒息前一般情況比較()Table 1 Baseline data for the three groups

表1 三組大鼠的誘導窒息前一般情況比較()Table 1 Baseline data for the three groups

注:三組間比較,#P＜0.05, 與Ⅰ組比較,☆P＜0.05。 計量資料組間比較采用單因素方差分析,計數資料比較采用Fisher 確切檢驗法。Note.Comparison between three groups, #P＜0.05.Compared with Group Ⅰ, ☆P＜0.05.One-way ANOVA analysis was used for measurement data comparisons between groups, and Fisher’s exact test was used for enumeration data comparison.

組別GroupsⅠ組(n=10)Group ⅠⅡ組(n=30)Group ⅡⅢ組(n=10)Group Ⅲ檢驗值Test value P 值P value體量(g)Weight 289.60±7.56☆ 325.3±10.79☆ 360.20±2.66☆ F=455.532# ＜0.001肛溫(℃)Temperature 35.79±0.58 35.47±0.97 35.77±0.95 F=0.702 0.501心率(次/分)HR 427.00±27.53 439.33±26.53 442.30±15.96 F=1.141 0.328平均動脈壓(mmHg)MAP 121.30±11.74 127.30±12.95 128.90±6.30 F=1.262 0.292窒息致心臟停搏時間(s)Asphyxia to cardiac arrest time 220.60±34.94 207.87±30.11 212.60±31.14 F=0.631 0.537心臟驟停持續時間(s)Cardiac arrest duration 363.60±6.64 362.77±5.98 363.20±6.63 F=0.072 0.931心室停搏Asystole 0 2 2心室顫動Ventricular fibrillation 0 0 0 χ2=2.378# 0.214無脈性電活動Pulseless electrical activity 10 28 8

表2 三組大鼠的復蘇數據比較Table 2 Comparison of resuscitation data of three groups of rats

表3 三組大鼠的ROSC 后的血流動力學比較( ,M (QL, QU))Table 3 Hemodynamic comparison of three groups of rats after ROSC

表3 三組大鼠的ROSC 后的血流動力學比較( ,M (QL, QU))Table 3 Hemodynamic comparison of three groups of rats after ROSC

注:三組間比較,★P＜0.05,與Ⅰ組比較,☆P＜0.05。 組間比較采用單因素方差分析；#,采用Kruskal-Wallis H 檢驗；*,n=17。Note.Comparison between three groups,★P＜0.05.Compared with Group Ⅰ, ☆P＜0.05.Comparisons between groups were used by One-way ANOVA analysis.#, Compared by Kruskal-Wallis H test.*, n=17.

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圖1 三組大鼠的ROSC 后Kaplan-Meier 生存曲線Figure 1 Kaplan-Meier survival curve after ROSC in three groups of rats

2.5.2 一般情況與結局的二分類Logistic 回歸分析

將體重、肛溫、HR、MAP、ACA 時間、CA 持續時間,共6 項為自變量,分別納入是否ROSC(χ2=25.115,P ＜0.001)、存活6 h(χ2= 11.760,P =0.003)、存活24 h(χ2=10.300,P=0.001)、存活72 h(χ2=14.191,P=0.001)的多因素二分類Logistic回歸分析,獲得的回歸方程具有統計學意義。 其中ROSC 與ACA 時間呈正相關；存活6 h 與體重呈負相關,ACA 時間呈正相關；存活24 h 與HR 呈負相關；存活72 h 與體重、HR 呈負相關(均P ＜0.05,詳見表5)。

3 討論

CA 患者ROSC 后會出現類似膿毒癥樣改變,導致多器官功能障礙綜合征的癥狀而導致預后差[14],可能與機體經過缺血、缺氧、再灌注損傷等一些列打擊后,血管活性物質、炎癥因子、神經內分泌調節、血流動力學等處于混亂狀態,導致全身組織器官血流灌注不足,使臟器功能逐漸受損,這一系列反應被稱為PCAS。 基于倫理的要求,目前關于PCAS 的干預研究,大部分都從動物實驗開始論證[15]。 但由于各個實驗室的動物來源、實驗室條件、總體研究方案的不同,而影響了結果的可比性[16]。 本研究希望窒息法致大鼠CA-CPR 模型,并從ROSC 成功率、復蘇后器官血流動力學情況、神經功能評分、生存結局等方面來分析和探討影響造模成功率的因素。

3.1 CA-CPR 模型造模成功的影響因素

3.1.1 CA-CPR 模型造模與一般情況的關系

研究發現,體重較輕的大鼠在ROSC 成功率以及生存率方面顯示出更好的趨勢,而且這種趨勢在神經功能(NDS 評分)以及復蘇后的血流動力學方面均存在；ACA 時間、基線的心率、體重與結局相關。

學者通過內分泌、骨齡等評估,證實大鼠的周齡與體重呈正相關[12],老年鼠與成年鼠對比,耐受缺氧的能力更差,表現為心排量、心率的下降[17]。 病理狀態下心率、平均動脈壓與心排量均為正相關[18],但是也有文獻證明心排量在某個區間,三者的關系非線性而是呈壓力-容積曲線環的關系[19]。 全身麻醉后行動脈置管的大鼠,基礎心率都會上升并維持一段較長的時間,這可能與麻醉、手術的應激有關[20]。 不同的麻醉藥物對循環系統影響雖有一定差別,但總體是負性影響[21-22]。

表4 三組大鼠的ROSC 后的NDS 評分比較(M (QL, QU))Table 4 NDS Comparison between three groups of rats after ROSC

表5 一般情況與模型結局的Logistic 分析(,M (QL, QU))Table 5 Logistic analysis between baseline data and model outcome

表5 一般情況與模型結局的Logistic 分析(,M (QL, QU))Table 5 Logistic analysis between baseline data and model outcome

組別Groups統計結果Statis tical results體量(g)Weight心率(次/分)HR窒息致心臟停搏時間(s)ACA自主循環恢復 OR(95% CI) / / 1.087(1.031-1.146)ROSC P 值 / / 0.002生存6 h OR(95% CI) 0.968(0.941-0.996) / 1.024(1.002-1.046)Survival 6 h P 值 0.023 / 0.029生存24 h OR(95% CI) / 0.955(0.925-0.986) /Survival 24 h P 值 / 0.005 /生存72 h OR(95% CI) 0.953(0.915-0.992) 0.957(0.921-0.994) /Survival 72 h P 值 0.019 0.023 /

本研究各組大鼠手術后平均動脈壓無統計學差異,經回歸分析發現大鼠的心率越慢,24 h 及72 h的生存率越高；ACA 時間越長ROSC 成功率與6 h的生存率越高。 這與麻醉及手術的損傷、心臟儲備、耐受缺氧能力有關。 因此,基線的心率低、ACA時間長、體重輕的大鼠,總體預后較好。

3.1.2 CA-CPR 模型造模與實驗技術的關系

若實驗者氣管插管、動脈置管的技術不嫻熟,則出現手術時間過長,甚至需要追加麻醉藥,導致手術的損傷大、麻醉相關不良反應多,最終影響心臟的儲備功能,降低造模成功率。 因此,提高相關手術的熟練程度,減少手術的損傷,縮短手術時間,減少麻醉用量,可能是提高CA-CPR 模型的造模成功率的重要手段。

3.2 CA-CPR 模型的動物模型選擇與生產率轉化之間的探討

動物實驗中,由于老年鼠的器官機能較成年鼠低下,同時可能存在各種合并疾病,所以一般選擇6-8 周的大鼠進行實驗[23]。 但如果研究對象是老年特有的狀態,如認知功能[24]、老年心肌功能[25]或衰老機能[26],則仍會選擇老年鼠。

臨床上,大多數CA 的患者均為高齡且合并多種慢性疾病[27],這些合并癥可能會影響CA 的病理生理并改變治療方法[28],目前選擇的動物模型無法真正模擬臨床CA 的嚴重程度[29-31],這會限制將研究結果從動物模型轉化為臨床環境的能力[6]。 因此國內外的CA-CPR 模型往往會選擇周齡較大的成年鼠作為研究對象[8]。 但是本研究表明,體重輕(周齡小)的大鼠更容易實現ROSC,如何在這兩方面取得平衡,需要開展后續的CA-CPR 模型研究。

此外,窒息是導致兒童CA 的主要原因[32],院內心臟驟停多數源于呼吸衰竭[33],所以窒息法造模對應的此類CA。 同時臨床搶救CA,更多的是實施基礎生命支持,而非已經行高級氣道的高級生命支持[34]。 雖然大多數動物實驗都是實施標準化的CPR,但在CPR 期間的移位或其他干預對冠狀動脈灌注壓、心肌血流的潛在影響使胸外按壓質量的評估成為在CPR 期間需要測量的重要參數。 尤其在無盲法的研究中,評價胸外按壓質量更加重要。 這些因素均需要在CPR 動物研究中有所考慮。

4 結論

本研究探討窒息法致大鼠CA-CPR 模型的造模成功率、生存結局分析的影響因素。 研究發現,在標準造模條件下,體重較輕的成年鼠,具有較高的建模成功率；大鼠的基線心率、體重與大鼠的生存結局成負相關,ACA 時間與良好的結局呈正相關。