阿司匹林通過調節CTRP6 抑制糖尿病大鼠心肌纖維化和炎癥反應

厲歆然,劉建軍,蔣 磊

(安徽省第二人民醫院 藥學部,合肥 230061)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是威脅人類健康最常見、最重要且無法根治的慢性代謝性疾病之一。 隨著人們生活水準提高,飲食結構改變及老齡化嚴重,糖尿病發病率明顯增加[1]。 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引發,獨立于冠狀動脈疾病或高血壓的心臟疾病,是糖尿病患者心力衰竭高患病率及高致死率的主要原因之一。 心肌間質重構及纖維化是DCM 的特征性病理表現。 近期研究亦發現炎癥反應與DCM 密切相關[2-3]。 因此,深入研究糖尿病心肌纖維化、炎癥反應與DCM 的關系及其分子作用機制尤為重要。

C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白6(C1/qtumor necrosis factor-related protein 6,CTRP6)是新進發現的一類脂肪因子蛋白超家族成員之一[4-5]。 其廣泛表達于人體組織器官(胎盤、心臟、腎等),參與包括心血管疾病、糖尿病和肥胖癥等疾病發生發展[6]。既往研究表明,CTRP6 參與多種病理狀態下組織和器官炎癥反應以及纖維化的發生與發展[7]。 在大鼠心肌梗死模型中,CTRP6 表達顯著降低,過表達CTRP6 可以改善大鼠心肌梗死后新功能障礙和心室重構[8]。 但是有關CTRP6 在糖尿病心肌纖維化和炎癥反應中的作用尚不清楚。 本研究建立糖尿病心肌病大鼠模型,觀察給予阿司匹林藥物干預后大鼠心肌組織纖維化狀況,炎癥反應以及CTRP6 蛋白表達變化,探究其對糖尿病心肌病的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級,6 ～8 周,雄性,SD 大鼠30 只,體重為180～200 g,由安徽醫科大學動物試驗中心提供[SCXK(皖)2017-001],實驗在安徽醫科大學[SYXK(皖)2017-004]進行。 本實驗方案通過安徽醫科大學動物倫理委員會審核批準(20170625004),實驗按照3R 原則給予相關人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素和CTRP6 抗體均購自于美國Cell Signaling Technology 公司；Tubulin 抗體購自于武漢博士德公司；RT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 生物公司；CTRP6 引物設計由上海生工生物工程公司完成；實驗使用二抗購自于武漢博士德公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液購自于江蘇碧云天公司；實驗所需耗材購自于北京中杉金橋生物技術公司。

組織勻漿儀:武漢維塞爾生物科技有限公司；-80℃超低溫冰箱:青島海爾集團；低溫冰箱:合肥美菱股份有限公司；多功能酶標儀:Thermo 賽默飛世爾；高速臺式冷凍離心機:湖南湘儀實驗室儀器有限公司； 熒光倒置顯微鏡: 日本/奧林巴斯Olympus；PCR 儀器:Bio-Rad 伯樂；Western blot 檢測裝置:美國Bio-Rad 伯樂公司；高純水機:美國Millipore 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物處理與分組

選取健康雄性SD 大鼠,體重180 ～200 g,適應性喂養一周后隨機分為三組每組各10 只,糖尿病組和阿司匹林組大鼠腹腔內注射STZ(60 mg/kg)構建DM 模型,對照組大鼠給予等容積生理鹽水腹腔注射。 對于血糖值連續3 d 均高于16.7 mmol/L 大鼠視為DM 造模成功。 第4 天起,阿司匹林處理組給予生理鹽水溶解的阿司匹林1 mg/(kg·d)灌胃,正常對照組和糖尿病組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。 模型建立成功10 周后檢測大鼠體重、血糖、血脂、空腹胰島素等。

1.3.2 超聲心動圖檢測

將大鼠麻醉,前胸部皮膚用脫毛膏備皮,仰臥位。 采用Vevo 770 動物高分辨率超聲成像系統評價實驗大鼠的心臟結構及功能。 選用RMB 716 大鼠高頻探頭,在二維影像指導下,用M 超在左室長軸切面測量IVSd:舒張末期室間隔厚度；IVSs:收縮末期室間隔厚度；LVIDd:舒張末期左室內徑；LVIDs:收縮末期左室內徑；LVPWd:舒張末期左室后壁厚度；LVPWs:收縮末期左室后壁厚度；并計算左室射血分數LVEF 及左室短軸縮短率(FS)=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd,根據EF 與FS 評價左室收縮功能。 把取樣容積置于二尖瓣前葉瓣環處記錄組織多普勒圖像,測量舒張早期二尖瓣半環速度峰值(E′)和舒張晚期二尖瓣半環速度峰值(A′),計算E′/A′,根據舒張期二尖瓣E 峰、A 峰速度及E′/A′比值來評價大鼠左心室舒張功能。 所有測量均由同一操作者完成,連續測定5 個心動周期,取其平均值。

1.3.3 心肌組織形態學觀察

心肌組織4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋、切片,行Masson 染色觀察大鼠心肌形態、間質膠原和心肌纖維化情況。

1.3.4 酶聯免疫吸附測定(ELSIA)

按照中杉金橋生物有限公司大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α 檢測試劑盒說明書進行含量測定。 具體步驟如下:

1)標準品加樣:96 孔酶標包被板,每孔加入50 μL 不同濃度的標準品溶液；

2)待測品加樣:將待測樣品稀釋5 倍后加入酶標板內,輕輕搖晃并混勻；

3)加酶:每孔加入100 μL 酶試劑；

4)孵育:封板膜封板后,置于37℃恒溫烘箱內孵育1 h；

5)稀釋液配置:使用去離子水稀釋20×的濃縮液為1×備用；

6)洗滌酶標板:揭去封板膜,傾去液體,并加入洗滌液清洗,重復3～5 次,甩干；

7)顯色:每孔加入A:B=1 ∶1 (50 μL:50 μL),輕搖混勻后,避光置于37℃恒溫烘箱內孵育15 min；

8)終止反應:每孔加入50 μL 終止液,終止顯色反應；

9)吸光度測定:單功能酶標儀450 nm 處測定各孔吸光度值。

1.3.5 實時熒光定量PCR

利用TRIzol 提取各組大鼠心肌組織總mRNA,將總的mRNA 逆轉錄成cDNA,按照說明書進行PCR 擴增。 PCR 引物設計如表1。

1.3.6 Western blot

1)取出大鼠的心肌,剪碎后放置于1.5 mL 的組織研磨管內并按照1 ∶2 ～1 ∶3比例加入組織裂解液放置在已經預冷后的組織勻漿儀中進行研磨；2)實驗樣本放置于4℃轉速設置為12000 r/min的高速離心機內,離心15 min,收集組織上清液,并進行蛋白質濃度測定；3)蛋白質凝膠電泳,濕轉轉膜,孵育CTRP6 和Tubulin 抗體(1 ∶1000)4℃過夜,孵育山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(1 ∶5000)室溫1 h；4)洗膜,滴加適量的顯影液,顯影并拍照。CTRP6 蛋白表達量通過Image J 軟件分析灰度值得到相對表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據統計分析,數據采用平均數±標準差()表示,采用ANOVA 分析方法用于多組之間比較,采用t 檢驗方法用于兩組間差異的比較,統計數據的結果以P＜0.05 被為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿司匹林對糖尿病大鼠心功能的影響

超聲心動圖常用于無創評價心功能,各組大鼠飼養10 周后進行大鼠超聲心動圖檢測。 在小動物超聲影像學的指引下,對大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 相關參數進行測量,并計算得出EF 和FS。 通過EF 和FS 評價大鼠左心室收縮功能；同時檢測各組大鼠舒張期二尖瓣血流E峰、A 峰,并計算E/A 比值評價大鼠左心室舒張功能。 結果顯示,與Control 組相比,DM 組大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 均 顯 著 升 高(P ＜0.05,P＜0.01),EF,FS 和E/A 水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01)；與DM 組相比,Aspirin 藥物干預 組 可 以 顯 著 降 低 IVSd、 IVSs、 LVPWd 及LVPWs 參數指標,改善EF,FS 和E/A 水平。 以上結果表明Aspirin 可以改善糖尿病大鼠心肌結構損傷和功能異常(見表2)。

表1 CTRP6 和Tubulin 上下游引物序列Table 1 CTRP6 and Tubulin forward primer and reverse primer sequences

2.2 阿司匹林對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響

為探究Aspirin 對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響,本研究通過Masson 染色觀察各組大鼠心肌纖維化狀況。 結果發現,糖尿病大鼠心肌間質和心肌微血管周圍膠原沉積增多、纖維化發生情況顯著,給予Aspirin 藥物干預后可顯著降低糖尿病大鼠心肌纖維化狀況,改善心肌結構與功能(見圖1)。

2.3 阿司匹林對糖尿病大鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的影響

為探究阿司匹林對大鼠心肌炎癥的影響,本研究通過ELSIA 檢測各組大鼠心肌組織勻漿后炎癥細胞因子含量。 結果顯示,DM 組IL-β、IL-6、TNF-α含量顯著增加(P＜0.01)；給予阿司匹林藥物干預后可顯著降低IL-β、IL-6、TNF-α 含量(P ＜0.05,P ＜0.01)(見表3)。

2.4 阿司匹林對CTRP6 蛋白表達的影響

為探究阿司匹林對糖尿病心肌纖維化和炎癥反應的機制影響,本研究通過RT-PCR 和Western blot 檢測抗炎蛋白CTRP6 的表達水平。 結果顯示,與Control 組相比,DM 組大鼠心肌組織CTRP6 表達顯著降低(P＜0.05,P＜0.01)；相比與DM 組,Aspirin處理組可顯著上調CTRP6 蛋白表達(P＜0.05,P＜0.01)(見圖2A、圖2B)。

表2 各組大鼠左心室功能超聲心動圖參數( )Table 2 Left ventricular function echocardiographic parameters of rats in each group

表2 各組大鼠左心室功能超聲心動圖參數( )Table 2 Left ventricular function echocardiographic parameters of rats in each group

注:與對照組相比, **P＜0.01；與糖尿病組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

參數Parameters對照組Control糖尿病組DM阿司匹林組Aspirin IVSd (mm) 1.52±0.06 1.88±0.07** 1.63±0.05##IVSs (mm) 1.93±0.09 2.72±0.10** 2.34±0.11##LVIDd (mm) 6.81±0.12 8.02±0.09** 7.87±0.12#LVIDs (mm) 4.14±0.19 5.76±0.06** 5.28±0.19##LVPWd (mm) 1.07±0.08 1.96±0.11** 1.67±0.09##LVPWs (mm) 1.54±0.08 2.50±0.16** 2.25±0.20#EF (%) 73.79±1.78 67.54±1.75** 70.29±2.03#FS (%) 40.20±2.31 30.29±3.01** 34.48±2.95#E/A 1.62±0.23 1.32±0.07** 1.50±0.09##

圖1 各組大鼠心肌纖維化狀況Figure 1 Myocardial fibrosis status of rats in each group

3 討論

糖尿病為慢性代謝性疾病,易產生多種并發癥,其中心血管并發癥約占糖尿病患者死亡率的65%。 糖尿病心肌病是一種獨立于高血壓和冠心病的心肌結構和功能變化的病理亞群,主要表現為心肌纖維化和心肌肥厚。 心肌纖維化是指心臟中膠原蛋白的過多生成、沉積,最終導致瘢痕組織過度增生的一種心臟病理性改變[9-10]。 研究證實,心肌受損時會誘發心肌細胞的凋亡、壞死、焦亡等進而激活肌成纖維細胞,啟動組織修復。 異常的病理條件下,誘導因子會持續性的激活肌成纖維細胞,導致心肌纖維化的發生[11]。 糖尿病心肌纖維化是糖尿病心肌病發生的一個重要原因,但是有關纖維化的藥物治療尚不完全明確。 因此,通過有效藥物干預抑制心肌纖維化過程對糖尿病心肌病的治療至關重要。

Aspirin 為一種經典的解熱鎮痛、非甾體抗炎藥、抗血小板聚集藥。 研究發現Aspirin 可以改善糖尿病合并的大血管和微血管病變,降低細胞炎癥反應[12]；Aspirin 可通過抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)膠原合成以及活性氧的產生以及抑制IL-18 誘導的CFs 增殖,改善心肌細胞功能[13-14]。 以上研究共同表明Aspirin可能發揮潛在的抗心肌纖維化以及炎癥作用。 但是有關Aspirin 與糖尿病心肌病心肌纖維化的關系未有報道。 為此,本研究通過Aspirin 1 mg/(kg·d)大鼠灌胃處理10 周,觀察大鼠心臟功能變化以及心肌纖維化狀況。 結果顯示,相比與Control 組,DM 組大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 均顯著升高,EF,FS 和E/A 水平顯著降低,表明糖尿病大鼠心臟結構和功能出現嚴重損傷；給予Aspirin 后可以改善糖尿病大鼠心臟結構損傷和功能異常。 Masson 染色發現,DM 組大鼠心肌間質和血管周圍膠原沉積增多,Aspirin 組大鼠心肌膠原沉積顯著減少。 炎癥在DCM 發生發展中同樣扮演重要作用。 既往研究發現在糖尿病大鼠心肌組織和血漿中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等顯著升高[15]。 體外細胞實驗:IL-1β 處理新生大鼠心肌細胞導致其收縮功能異常,脂質過氧化和蛋白質氧化增加,通過抑制IL-1β 可以降低上述效應[16]。 本研究通過ELSIA 檢測各組大鼠心肌組織炎癥細胞因子水平,結果發現,與Control 組相比,DM 組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α 含量顯著增加,給予Aspirin 干預后可降低上述炎癥因子釋放。 以上結果共同表明Aspirin 可通過降低糖尿病大鼠心肌纖維化狀況抑制炎癥反應,改善心肌結構與功能。

表3 各組大鼠IL-β、IL-6、TNF-α 水平比較( )Table 3 Comparison of IL-β, IL-6 and TNF-α levels of rats in each group

表3 各組大鼠IL-β、IL-6、TNF-α 水平比較( )Table 3 Comparison of IL-β, IL-6 and TNF-α levels of rats in each group

注:與對照組相比,**P＜0.01；與糖尿病組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups IL-1β(ng/L) IL-6(ng/L) TNF-α(ng/L)對照組Control group 41.4±21.8 23.1±7.2 300.5±28.8糖尿病組DM group 97.5±19.1** 50.2±7.0** 877.3±40.9**阿司匹林組Aspirin group 68.9±10.1## 39.9±8.4# 687.3±21.5##

圖2 各組大鼠心肌組織CTRP6 表達變化Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 2 Changes of CTRP6 expression in rat myocardium

CTRP6 參與多種組織炎癥反應與纖維化過程。在慶大霉素誘導的大鼠急性腎損傷模型中血清CTRP6 含量顯著降低,注射CTRP6 腺病毒載體可以降低大鼠血清中尿素氮和血清肌酐含量,進一步研究CTRP6 干預可以顯著降低大鼠腎組織中IL-1β和TNF-α 含 量[17-18]。 在 大 鼠 心 肌 梗 死 模 型 中CTRP6 表達顯著降低,外源性過表達CTRP6 可以抑制TGF-β1 誘導肌成纖維細胞轉化[19]。 但是有關CTRP6 與糖尿病心肌纖維化和炎癥反應的關系尚不清晰。 在本研究中我們通過RT-PCR 和Western blot 檢測大鼠心組織CTRP6 表達變化。 結果發現DM 組心肌組織CTRP6 mRNA 和蛋白表達均顯著降低,給予Aspirin 藥物干預后可以抑制CTRP6 表達的下調,改善糖尿病心肌纖維化與炎癥反應。

綜上所述,本研究通過探究Aspirin 對糖尿病大鼠心肌纖維化和炎癥反應的影響及其分子作用機制。 結果發現Aspirin 可以促進CTRP6 表達抑制糖尿病心肌纖維化和炎癥反應進而改善心肌結構與功能。 以上研究結果為Aspirin 用于治療糖尿病心肌纖維化和炎癥反應提供了理論依據。