兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫的建立與思考

龐爽，白曉紅，王圣治，陳穎，趙詩語，李啟英，張君

·生物樣本庫建設(shè)·

兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫的建立與思考

龐爽，白曉紅，王圣治，陳穎，趙詩語，李啟英，張君

200433 上海，復(fù)旦大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（龐爽）；110033 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科（白曉紅、張君），腎內(nèi)科（王圣治）； 200072 沈陽，遼北中醫(yī)院兒科（陳穎）；110032 沈陽，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院（趙詩語、李啟英）

過敏性紫癜（henoch-sch?nlein purpura，HSP）是好發(fā)于學(xué)齡期兒童的以壞死性小血管炎為主要病理改變的全身性疾病，主要表現(xiàn)為皮膚紫癜、關(guān)節(jié)腫痛、胃腸道出血等。紫癜性腎炎（henoch-sch?nlein purpura nephritis，HSPN）是繼發(fā)于 HSP 的腎臟損害，是 HSP 最首要的致死原因[1]。在 HSP 首次發(fā)作后 4 ~ 6 周，約 40% 的患兒病情加重進展為 HSPN[2-3]。

舌診是中醫(yī)獨特的診斷方法，尤其對“啞科”兒科而言，舌診具有重要的臨床意義。小兒口不能言，或雖能言但不足信，因此兒科診法多以望診為主，尤其是望舌，舌與五臟六腑之精氣密切相關(guān)，能反映臟腑氣血陰陽的生理病理變化，為兒科臨床辨證論治不可缺少的客觀依據(jù)。脫落細胞與菌群微生物是舌苔形成和變化的重要因素，兩者相互作用，對舌苔上皮細胞的新陳代謝產(chǎn)生重要影響[4]。

近年來，國內(nèi)外對舌苔的研究不斷深入，得到了很多有意義的數(shù)據(jù)[5-9]，包括舌苔脫落細胞、舌苔微生態(tài)變化等重要數(shù)據(jù)信息，若在此基礎(chǔ)上進一步研究，可節(jié)省大量時間和精力，然而面臨兩個問題：①有的研究原始數(shù)據(jù)信息（如患兒臨床信息、舌苔微生態(tài)測序原始數(shù)據(jù)等）尚未完全公開；②一些特殊病例（如 HSPN 伴皮膚破潰、家族性 HSPN 等）由于未備份樣本，即使數(shù)據(jù)完整，也無法再一次對原始樣本進行深入研究。因此，本研究針對兒童紫癜性腎炎擬建立一個樣本儲存完善、數(shù)據(jù)收錄完整的舌苔生物樣本庫，每一份舌苔樣本對應(yīng)完整的患兒臨床信息、舌苔脫落細胞研究數(shù)據(jù)和舌苔微生態(tài)研究數(shù)據(jù)，使之成為一個“臨床信息-舌苔樣本-科研數(shù)據(jù)”資源共享的研究平臺。研究者可利用平臺的已有樣本和數(shù)據(jù)信息，開展多中心舌苔臨床課題、疾病發(fā)病機制、“中醫(yī)-微生態(tài)學(xué)”舌診現(xiàn)代化等相關(guān)深入研究（圖 1）。

1 基礎(chǔ)建設(shè)

1.1 人員配備

目前生物樣本庫現(xiàn)有專職研究員 2 人、專業(yè)技術(shù)員5 人，涉及檢驗、臨床和細胞生物學(xué)等專業(yè)領(lǐng)域。全體生物樣本庫工作人員均經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，對樣本采集、運輸、處理、儲存、質(zhì)控、出入庫、回收等工作均能勝任，并定期進行標(biāo)準(zhǔn)化操作、設(shè)備安全操作等培訓(xùn)。

1.2 設(shè)施與環(huán)境

生物樣本庫位于醫(yī)院科研樓四樓，總建筑面積約200 m2，由樣本接受區(qū)、樣本中心實驗室、樣本儲存區(qū)、信息管理區(qū)和辦公室五部分組成。樣本儲存區(qū)包括液氮儲存室 1 間、超低溫（–80 ℃）冰箱儲存室 2間。樣本庫配備超低溫冰箱、氣相液氮罐、溫濕度監(jiān)控系統(tǒng)、生物安全柜、高速冷凍離心機、條碼打印機、激光掃碼槍、DNA 自動化抽提儀、實時熒光定量 PCR 儀、多功能酶標(biāo)儀等相關(guān)設(shè)備，可完成對樣本的初步處理和深度加工。同時配備雙電路系統(tǒng)和超低溫冰箱冷鏈監(jiān)控系統(tǒng)，有專人定期對超低溫冰箱進行維護和保養(yǎng)，以保證樣本的質(zhì)量安全。

1.3 信息系統(tǒng)

信息管理區(qū)使用海爾生物醫(yī)療開發(fā)的樣本庫信息化管理系統(tǒng)（biobank information management system，BIMS）對入庫標(biāo)本進行智能化管理，包括樣本管理、樣本源管理、容器管理、科研項目管理、權(quán)限管理等。其中樣本管理包括樣本編碼、取材處理、儲存記錄、出入庫記錄、質(zhì)量控制等信息；樣本源管理包括知情同意書、患兒基本資料、體格檢查信息、實驗室檢查結(jié)果、舌苔影像圖片等信息；科研項目管理包括舌苔脫落細胞和舌苔微生態(tài)研究相關(guān)數(shù)據(jù)信息，以及出庫樣本的實驗數(shù)據(jù)結(jié)果。系統(tǒng)可設(shè)置使用者權(quán)限，可查詢操作痕跡，對所有數(shù)據(jù)均可自動化備份，從而保證信息系統(tǒng)的數(shù)據(jù)安全。

2 臨床樣本收集

2.1 簽署知情同意

提交倫理申請，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批合格后收集患兒舌苔樣本，需告知患兒及其監(jiān)護人相關(guān)事宜并簽署知情同意書。知情同意書備份至 BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)的樣本源管理。

2.2 病例納入

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會制訂的《紫癜性腎炎診治循證指南（2016）》[10]，收集患兒病例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合西醫(yī) HSPN 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床分型屬孤立性血尿或孤立性蛋白尿、血尿和蛋白尿、急性腎炎型者；③年齡在 3 ~ 18 歲之間，包括 3 歲和 18 歲；④近 6 個月未使用任何抗生素、微生物制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物；⑤愿意配合并簽署知情同意書。如以上納入標(biāo)準(zhǔn)中有任何一項為“否”，則該患兒不能被納入。

圖 1 兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫研究平臺

圖 2 紫癜性腎炎患兒舌苔影像采集

排除標(biāo)準(zhǔn)：①紫癜性腎炎出現(xiàn)腎功能不全者；②紫癜性腎炎臨床分型屬于腎病綜合征型、急進性腎小球腎炎型、慢性腎小球腎炎型；③合并有嚴(yán)重的呼吸、消化、血液、肝臟等原發(fā)性疾病或腫瘤、精神病、傳染病患者。④年齡< 3 歲或年齡 > 18 歲；⑤近兩周參加其他臨床試驗者；⑥未簽署知情同意者；⑦不能配合舌苔采集者。如以上排除標(biāo)準(zhǔn)中有任何一項為“是”，則該患兒不能被納入。

2.3 臨床信息收集

由兩名醫(yī)務(wù)人員記錄患兒一般情況、現(xiàn)病史、既往史、用藥情況等，并記錄體格檢查（包括身高、體重、血壓、呼吸次數(shù)、心率、心律、體溫等）和實驗室檢查（包括尿常規(guī)、尿 β2微球蛋白、24 h 尿蛋白定量、血常規(guī)、血脂、血沉、免疫球蛋白、補體、腎臟彩超、肝功能、腎功能、心電圖等）等相關(guān)數(shù)據(jù)。參照馬融主編的十三五國家高等教育規(guī)劃教材《中醫(yī)兒科學(xué)》（新世紀(jì)第四版），對患兒舌象、脈象及中醫(yī)證型進行判斷并記錄。以上信息由兩名工作人員確認(rèn)無誤后，導(dǎo)入 BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)的樣本源管理。

2.4 舌苔影像采集

為排除染苔和飲食的影響，清晨患兒空腹?fàn)顟B(tài)下采集舌苔影像。采集前患兒用無菌 0.9% 氯化鈉溶液漱口 3 次，取坐位張口伸舌，盡量暴露全舌于自然光線下，用高清攝像頭（像素> 1000 萬）拍攝圖像（圖 2），對圖像標(biāo)注名稱，記錄采集時間，與患兒臨床信息一一對應(yīng)，導(dǎo)入 BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)的樣本源管理。

2.5 舌苔樣本收集

使用五點采樣法收集舌苔樣本用于微生態(tài)研究：①采集前患兒用無菌 0.9% 氯化鈉溶液漱口 3 次，囑患兒充分暴露全舌；②用口腔植絨采樣拭子在患兒舌根、舌中部、舌兩側(cè)、舌尖來回刮拭 5 ~ 10 次；③采樣后立即放入樣品收集管內(nèi)，及時封閉管口避免污染；④標(biāo)記患兒編號及采集時間，每名患兒采樣 5 份。

舌苔脫落細胞采樣方法：①采集前患兒用無菌 0.9% 氯化鈉溶液漱口 3 次，囑患兒充分暴露全舌；②用一次性壓舌板以中等力度從患兒舌中部輕輕刮取舌苔上浮物質(zhì)，并立刻沿同一方向均勻涂在載玻片上；③迅速以 95% 酒精脫水固定以防止舌苔脫落細胞溶解或變形；④標(biāo)記患兒編號及采集時間，每名患兒采樣 5 份。

3 樣本處理與保存

3.1 舌苔樣本運輸

由于溫度對微生物影響較大，舌苔微生態(tài)樣本需在采集后迅速放入便攜式液氮罐中，舌苔脫落細胞樣本則常溫密封運輸，由院內(nèi)配送人員及時送至生物樣本庫的樣本接受區(qū)。

3.2 舌苔樣本處理與入庫

樣本從采集到處理應(yīng)在 30 min 內(nèi)完成。對于舌苔脫落細胞采用巴氏染色法，試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，操作過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品所提供的使用說明書進行，最后用中性樹膠封片固定。對于舌苔微生態(tài)樣本，采用 Qiagen Mini 試劑盒提取舌苔微生物 DNA，并用統(tǒng)一凍存管分裝備份，避免樣本使用時反復(fù)凍融影響質(zhì)量。所有樣本通過中心實驗室激光掃碼槍及系統(tǒng)條碼識別完成樣本的入庫和相關(guān)信息的導(dǎo)入，兩種舌苔樣本要分開儲存，舌苔脫落細胞樣本封片于 4 ℃常溫保存，舌苔微生態(tài)樣本于–80 ℃超低溫冰箱保存。

3.3 舌苔樣本質(zhì)控

為保證兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫的樣本質(zhì)量，采用隨機抽檢的方法，每季度對庫內(nèi)樣本進行質(zhì)量控制。利用 NanoDrop2000 和瓊脂糖凝膠電泳對樣本 DNA 純度、濃度和完整性進行檢測（圖 3），同時對舌苔樣本的位置信息、臨床信息、圖像信息等正確性和完整性進行檢查。對于投入使用的出庫樣本，樣本庫將第一時間獲取研究者的使用反饋。

4 科研平臺

4.1 舌苔脫落細胞研究

4.1.1 鏡下觀察 用低倍鏡瀏覽全片，觀察涂片背景、細胞著色、細胞疊壓等情況，每張載玻片選取 5 個視野，要求每個視野在 100 倍顯微鏡下觀察細胞數(shù)> 50 個。觀察對象主要為角化前上皮細胞、不完全角化上皮細胞、完全角化上皮細胞。

運用電子顯微鏡成像系統(tǒng)，采集顯微鏡下細胞圖像并記錄脫落細胞分布情況。如圖 4 所示，鏡下上皮細胞核呈藍紫色、核仁呈紅色；角化前上皮細胞呈淡藍色或淡綠色；不完全角化上皮細胞呈粉紅色；完全角化上皮細胞呈橙色；紅細胞呈鮮紅色或橙紅色；白細胞胞質(zhì)呈淡藍或淡綠色，核呈藍紫色；黏液呈淡藍或粉紅色。將舌苔脫落細胞鏡下成像圖片導(dǎo)入 BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)的科研項目管理，與系統(tǒng)中樣本源管理的舌苔影像圖片一一對接（圖 5），為探索舌苔形成機制、舌苔變化與脫落細胞關(guān)系等相關(guān)研究提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)信息。

4.2 舌苔微生態(tài)研究

4.2.1 文庫構(gòu)建和測序 利用 Covaris M220 將舌苔微生態(tài)樣本 DNA 片段化（約 300 bp），使用 TruSeqTMDNA Sample Prep 試劑盒通過磁珠法篩選去除接頭自連片段，PCR 擴增進行文庫模板富集，構(gòu)建 PE 文庫。使用 HiSeq 3000/4000 PE ClusteR Kit 將 DNA 擴增子線性化成單鏈，利用 Illumina HiSeq 平臺進行測序[11-12]。

4.2.2 生信分析 對原始序列采用 Trimmomatic v0.38 進行數(shù)據(jù)優(yōu)化處理，利用 Usearch v7.0 軟件按照 97% 相似性進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，對得到的 OTU 聚類結(jié)果進行注釋及分類，得到各個分類水平上的物種組成分析、多樣性分析、差異分析和功能預(yù)測分析等[13]（圖 6）。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)的科研項目管理，研究者可根據(jù)舌苔微生態(tài)研究的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，挖掘有效信息，尋找紫癜性腎炎患兒舌苔的特異性菌屬[14]，開展舌象與舌苔微生態(tài)變化規(guī)律、“中醫(yī)-微生態(tài)學(xué)”舌診現(xiàn)代化、疾病發(fā)病機制等進一步深入研究，從菌群微生態(tài)的角度挖掘中醫(yī)舌診的科學(xué)內(nèi)涵。

1 ~ 7：隨機抽取的 7 個舌苔樣本 DNA

圖 4 舌苔脫落細胞顯微鏡下成像

圖 5 舌苔脫落細胞圖片導(dǎo)入BIMS 生物樣本庫管理系統(tǒng)

圖 6 舌苔微生態(tài)生信分析

5 樣本出庫及回收

申請者可向樣本庫提交樣本使用申請，經(jīng)樣本庫委員會審批后可執(zhí)行樣本出庫。在信息系統(tǒng)中的樣本管理做好出庫記錄，包括樣本出庫日期、數(shù)量、申請者信息、用途和使用期限等。兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫為申請者提供舌苔樣本、臨床數(shù)據(jù)信息、舌苔脫落細胞數(shù)據(jù)和舌苔微生態(tài)生信分析數(shù)據(jù)。

申請者在一定期限內(nèi)，執(zhí)行樣本返還工作，對質(zhì)量合格的剩余樣本可回收再次入庫，提高樣本利用率。同時申請者需提供相應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)，一并收錄到生物樣本庫中，實現(xiàn)樣本庫數(shù)據(jù)更新和資源共享。

6 討論

6.1 舌苔生物樣本庫建設(shè)意義

生物樣本庫是醫(yī)學(xué)研究的重要資源，能標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲存樣本，還可對樣本進行質(zhì)量控制、信息管理和數(shù)據(jù)共享[15]。近年來生物樣本庫建設(shè)在國內(nèi)逐漸升溫，體現(xiàn)了國家對生物樣本庫的高度重視。舌診是兒科中醫(yī)診斷不可或缺的重要部分，由于小兒無法準(zhǔn)確描述病情，察舌辨證就顯得尤為重要，通過觀察舌苔的變化，可判斷病邪性質(zhì)、病位深淺和邪正盛衰，進而指導(dǎo)兒科臨床用藥。

脫落細胞和微生態(tài)是舌苔研究中最基礎(chǔ)也是最重要的環(huán)節(jié)。舌苔生物樣本庫為研究者提供樣本的同時，共享樣本臨床信息、脫落細胞研究數(shù)據(jù)和微生態(tài)研究數(shù)據(jù)，既為研究人員提供規(guī)范化的高質(zhì)量樣本，又給予基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)支持，最大程度上節(jié)省研究人員的時間和精力，同時對出庫樣本的實驗數(shù)據(jù)備份，使數(shù)據(jù)不斷擴充和更新，生物樣本庫得以可持續(xù)性發(fā)展。這對中醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)等多學(xué)科交叉研究的開展以及提高我院承擔(dān)國家重大科研項目的能力具有深遠意義。

6.2 樣本采集過程中遇到的困難和解決方案

兒童屬于特殊群體，在樣本采集初期遇到的困難有：①兒童生長發(fā)育尚未成熟，舌苔質(zhì)薄，樣本量少；②兒童心理發(fā)育尚未成熟，采樣易產(chǎn)生恐懼，配合度差；③臨床醫(yī)師對樣本的標(biāo)準(zhǔn)化采集不夠了解，樣本質(zhì)量參差不齊。針對兒童采樣問題，我們通過不斷改進文案，力求表述簡明且生動，并采取模擬演示、禮物獎勵等方法，消除患兒恐懼心理。對專業(yè)人員進行規(guī)范化采樣培訓(xùn)，最大程度上減少采樣次數(shù)，增加對患兒的人文關(guān)愛。采用“五點取樣法”在患兒舌根、舌中部、舌兩側(cè)、舌尖盡可能多地采集舌苔樣本。在樣本處理環(huán)節(jié)不斷改進技術(shù)，提高 DNA 提取的濃度和純度。針對臨床醫(yī)師操作問題，指定專業(yè)人員在科室進行一對一指導(dǎo)，鼓勵醫(yī)護人員免費使用生物樣本，并提供相關(guān)科研咨詢，有力地提升了科室留取樣本的積極性和規(guī)范性。

6.3 舌苔生物樣本庫的應(yīng)用

關(guān)于舌苔的研究，已經(jīng)深入到細胞和分子水平，既往研究顯示，脫落細胞和菌群不僅影響苔色和苔質(zhì)，還可能參與某些疾病的發(fā)病機制[16-20]，因此舌苔的研究具有重要意義。對于兒童紫癜性腎炎舌苔樣本庫來說，其最大的特色是完整的配套數(shù)據(jù)，綜合性的數(shù)據(jù)信息可以幫助研究者更好地掌握研究對象的特性和功能。研究者可直接利用生物樣本庫提供的數(shù)據(jù)對不同類型舌苔進行分類比較等基礎(chǔ)研究，還可根據(jù)配套數(shù)據(jù)（如微生態(tài)生信分析等）進行分子機制探討等深入研究，可有效減少重復(fù)性研究對樣本的浪費，將寶貴的兒童樣本投入到更深層次的研究中。為多中心舌苔臨床研究、疾病發(fā)病機制、“中醫(yī)-微生態(tài)學(xué)”舌診現(xiàn)代化研究等多學(xué)科交叉的科研課題提供高質(zhì)量的樣本和共享數(shù)據(jù)，為科學(xué)研究帶來最大程度的幫助。

綜上，生物樣本庫建設(shè)的最終目的是服務(wù)于科學(xué)研究，其不單單是存儲的樣本庫，更應(yīng)是數(shù)據(jù)資源共享的樣本庫。本文擬建立兒童紫癜性腎炎舌苔生物樣本庫研究平臺，以臨床信息和舌苔樣本為核心，整合脫落細胞和微生態(tài)研究數(shù)據(jù)，為臨床、科研、教學(xué)提供高質(zhì)量樣本的同時，將生物樣本庫打造成可持續(xù)性發(fā)展的資源共享平臺。

[1] Kawasaki Y, Ono A, Ohara S, et al. Henoch-Sch?nlein purpura nephritis in childhood: pathogenesis, prognostic factors and treatment. Fukushima J Med Sci, 2013, 59(1):15-26.

[2] Saulsbury FT. Clinical update: Henoch-Sch?nlein purpura. Lancet, 2007, 369(9566):976-978.

[3] Sano H, Izumida M, Shimizu H, et al. Risk factors of renal involvement and significant proteinuria in Henoch-Sch?nlein purpura. Eur J Ped, 2002, 161(4):196-201.

[4] Li X, Zhang JF, Yang YP. Primary discussion of association of microecology and tongue coating. Liaoning J Traditional Chin Med, 2014, 41(6):1102-1106. (in Chinese)

李響, 張軍峰, 楊亞平. 舌苔形成的微生態(tài)學(xué)機制探討. 遼寧中醫(yī)雜志, 2014, 41(6):1102-1106.

[5] Zhou XF, Li X, Li FF. Study on tongue diagnose information of chronic renal failure with dampness-turbid sydnrome. Chin Arch Traditional Chin Med, 2018, 36(9):2146-2148. (in Chinese)

周小芳, 李雪, 李福鳳. 慢性腎衰虛兼濕濁證的舌象特征研究. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2018, 36(9):2146-2148.

[6] Wang ZW, Bao K, Lin WQ, et al. Analysis on tongue coating, the tubulointerstitial lesions and clinical characters in 376 cases with ldiopathic membranous nephropathy. Guiding J Traditional Chin Med Pharmacol, 2018, 24(19):48-52, 59. (in Chinese)

王志偉, 包崑, 林文秋, 等. 376例特發(fā)性膜性腎病患者舌苔、腎小管間質(zhì)損傷與臨床分析. 中醫(yī)藥導(dǎo)報, 2018, 24(19):48-52, 59.

[7] Pieralisi N, de Souza Bonfim-Mendon?a P, Negri M, et al. Tongue coating frequency and its colonization by yeasts in chronic kidney disease patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35(9):1455- 1462.

[8] Lin RY, Yu HY, Qin JY, et al. Association between tongue coating thickness and clinical characteristics among idiopathic membranous nephropathy patients. J Ethnopharmacol, 2015, 171:125-130.

[9] Hao Y, Yuan X, Yan J, et al. Metabolomic markers in tongue-coating samples from damp phlegm pattern patients of coronary heart disease and chronic renal failure. Dis Markers, 2019, 2019: 4106293.

[10] Nephrology Group of Academy of Pediatrics of Chinese Medicine Association. Diagnostic and evidence-based guidelines of Henoch-Sch?nlein purpura nephritis (2016). Chin J Pediatr, 2017, 55(9):647-651. (in Chinese)

中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟病學(xué)組. 紫癜性腎炎診治循證指南(2016). 中華兒科雜志, 2017, 55(9):647-651.

[11] Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods, 2010, 7(5):335-336.

[12] Edgar RC. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods, 2013, 10(10):996-998.

[13] Jiang XT, Peng X, Deng GH, et al. Illumina sequencing of 16S rRNA tag revealed spatial variations of bacterial communities in a mangrove wetland. Microb Ecol, 2013, 66(1):96-104.

[14] Oberauner L, Zachow C, Lackner S, et al. The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing. Sci Rep, 2013, 3:1413.

[15] Vaught J. Biobanking comes of age: the transition to biospecimen Science. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2016, 56:211-228.

[16] Sun S, Wei h, Zhu R, et al. Biology of the tongue coating and its value in disease diagnosis. Complement Med Res, 2018, 25(3):191-197.

[17] Lu H, Ren Z, Li A, et al. Tongue coating microbiome data distinguish patients with pancreatic head cancer from healthy controls. J Oral Microbiol, 2019, 11(1):1563409.

[18] Seerangaiyan K, Jüch F, Winkel EG. Tongue coating: its characteristics and role in intra-oral halitosis and general health-a review. J Breath Res, 2018, 12(3):034001.

[19] Ye W, Zhang Y, He M, et al. Relationship of tongue coating microbiome on volatile sulfur compounds in healthy and halitosis adults. J Breath Res, 2019, 14(1):016005.

[20] Bernardi S, Karygianni L, Filippi A, et al. Combining culture and culture-independent methods reveals new microbial composition of halitosis patients’ tongue biofilm. Microbiologyopen, 2020, 9(2):e958.

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項（201507001-03）

龐爽，Email：pangshuang@fudan.edu.cn

2020-02-10

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.003