兒童專科醫院樣本庫的生物樣本特征分析及策略建議

王新杰，王敏，黃楚天，周君梅

·生物樣本庫建設·

兒童專科醫院樣本庫的生物樣本特征分析及策略建議

王新杰，王敏，黃楚天，周君梅

200040 上海交通大學附屬兒童醫院/上海市兒童醫院生物樣本庫（王新杰、王敏、黃楚天、周君梅）；200127 上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心血液腫瘤科（王敏）

生物樣本庫為轉化研究提供重要的研究資源[1]，其通過與疾病特征和研究目的相關聯的頂層設計、系統規范地收集健康個體來源的和疾病個體來源的血液、組織、各種體液等樣本，經過與樣本特性相適宜的處理后再將樣本冷凍保存[2]。生物樣本庫的規范建設和科學管理至關重要，對各種樣本分析前變量開展質控研究以建立科學的樣本處理和存儲方案、從而最終為轉化研究提供高質量的樣本，越來越引起了研究者的重視[3-5]，也有望為解決研究結果的可重復性和可靠性提供思路[6]。傳統的生物樣本庫以采集和存儲各種生物大分子、體液、組織等不可再生的類型的樣本為主，隨著近年來對生物樣本庫“活庫”的重視，樣本庫的規劃與發展也迎來了新的挑戰，“活庫”以其獨特優勢有望成為未來下一代樣本庫的發展重點[7-8]。

近十年，各醫療機構和科研團體建立了各種主題的生物樣本庫。兒童專科醫院具有獨特的疾病種類，基于兒童疾病建立的生物樣本庫也具有獨特的樣本類型及其特征，對其進行深度分析，有助于明確現行存在的問題，從而及時調整樣本庫運行策略、為臨床提供更有力的資源平臺支撐。

1 樣本庫的運行、管理和數據分析

1.1 組織架構與運行流程

我院樣本庫的組織架構遵照常規樣本庫的管理模式[9]，包含軟件系統與硬件設施。軟件系統包括樣本庫的專職管理團隊、科室規章制度、樣本庫的信息管理系統等；硬件設施方面，樣本庫根據功能劃分為樣本接收區、樣本處理和質控區、樣本存儲區、信息管理區和庫房等幾大功能區。樣本庫的運行流程包括立項、采集、處理、質控及入庫等。樣本庫的日常運行及樣本出入庫流程受醫院的學術委員會和倫理委員會的管理與審核。

1.2 入庫管理及質控

我院采用“一病一卡”的管理制度，在入庫環節進行源頭質控[10]，根據疾病的診療特點和可能的研究需求確定疾病特異性的樣本采集計劃后遵照執行。臨床工作人員采集樣本后運送至樣本庫，由樣本庫專職人員進行樣本分裝、二維碼標簽粘貼、信息錄入、樣本入庫等操作。在存儲過程中，樣本信息及存儲位置由兩名工作人員共同核對確認，以保證信息的準確性。定期對在庫樣本進行質量自檢及送第三方質控，定期參與室間比對，以確保質控體系的可靠，保證樣本的全流程質控管理[11]。

1.3 數據管理及分析

樣本庫信息系統可自動定期對樣本庫數據進行統計和備份，同時，樣本庫管理人員也定期對入庫數據進行記錄、統計與分析。本次數據整理范圍為 2015 年 1 月 1 日 – 2019 年 7 月 1 日我院樣本庫入庫的樣本，間隔時間為半年，對各時間節點的樣本特征進行分析。

1.3.1 入庫樣本量及樣本類型變化分析 對每個時間節點的樣本總數和病例數進行統計，以時間為橫坐標繪制折線圖，反映兩者的變化趨勢；對數據統計始末的在庫樣本按照樣本類型進行分類，統計各類型樣本數，繪制餅圖展示各類型所占比例。

1.3.2 入庫樣本病種變化分析 將在庫樣本的疾病種類分為出生缺陷、兒童腫瘤、免疫異常、感染性疾病、代謝性疾病及其他等六大類別，在每個時間節點統計各疾病類別的樣本量及各自占比，以時間為橫坐標繪制堆積柱形圖，反映其變化趨勢；鑒于我院兒童專科醫院的特色，病種以出生缺陷為主，故進一步將出生缺陷類疾病分為結構畸形、功能缺陷、遺傳物質異常三類，繪制堆積柱形圖反映各自變化趨勢。

1.3.3 項目庫與戰略庫的變化分析 根據樣本入庫前是否有項目支撐，將樣本庫中子庫分為項目庫與戰略庫，統計近 5 年項目庫與戰略庫樣本量及各自占比，以時間為橫坐標繪制堆積柱形圖反映其變化趨勢。統計2015 年初與2019 年中項目庫與戰略庫樣本量及各自占比，分別以柱狀圖與餅圖總結其各自的變化趨勢。

2 兒童專科醫院樣本庫樣本特征分析結果

2.1 入庫樣本呈穩步增長趨勢，樣本類型仍以傳統類型為主

自 2015 年年初 – 2019 年年中，樣本庫飛速發展，入庫的樣本總數及病例數均呈穩步增長的趨勢（圖 1A）。樣本類型方面，各類型所占比例變化不大，仍以傳統類型為主，其中全血樣本占比最高，超過 50%，其次是 DNA 樣本及組織樣本，分別為 24.95% 及 10.82%。占比較少的其他類型樣本包括尿液、糞便以及誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）等，其中 iPSCs 為目前唯一一種活庫樣本（圖 1B）。

圖 1 樣本總數及病例數的變化趨勢（A）及各類型樣本的占比（B）

圖 2 疾病種類類型分析（A：病種特點；B：出生缺陷）

2.2 入庫樣本的病種分析結果呈現出兒童專科醫院的特點

基于兒童專科醫院特殊的疾病種類，樣本庫管理人員對來自多個臨床科室的樣本按照不同疾病類型進行分類統計。2015 年初，出生缺陷類疾病樣本占總樣本量的 40% 左右，為占比最大的疾病類型，病種無法明確歸類的其他類型疾病次之，兒童腫瘤再次之，免疫異常相關疾病樣本占比最少。自 2016 年年中起，感染性疾病樣本開始出現，至 2017 年年初，又新增了代謝性疾病樣本，但其余四種類型疾病的占比先后次序并無變化（圖 2A）。其中，作為兒童專科醫院特色病種，出生缺陷類疾病仍為占比最多的疾病類型，且樣本量持續增長，因此，將該疾病類型進一步細化分析。與 2015 年年初相比，近年來新增了功能缺陷疾病的樣本，原有結構畸形與遺傳物質異常疾病的樣本也持續增加，各類型占比變化不明顯（圖 2B）。

2.3 項目庫與戰略庫均呈增長態勢、但項目庫占比明顯提高

根據樣本入庫前是否有科研基金項目支撐，將樣本庫分為項目庫與戰略庫兩個子庫。2019 年年中，項目庫與戰略庫中的樣本數量均較初期有所增加，其中項目庫漲幅更大（圖 3A）。兩個子庫所占比例變化明顯，目前戰略庫子庫的絕對數雖仍多于項目庫，但其占比已從 2015 年年初的 78.57% 減少到了 2019 年年中的 52.17%，而項目庫則從 2015 年年初的 21.43% 增加到了 2019 年年中的 47.83%（圖3B）。

圖 3 項目庫與戰略庫的變化趨勢（A）及構成比變化（B）

3 總結與展望

生物樣本庫為轉化醫學研究儲備了極其重要的研究資源，因而，樣本庫的規范建設和科學管理極為重要，不僅體現在對在庫樣本的質量把關，更體現在樣本庫管理人員身為連接臨床與基礎的重要橋梁，需從宏觀角度分析樣本庫的在庫樣本特征、及時向管理部門和臨床科室反饋信息、根據在庫樣本特征及時調整樣本管理策略和為臨床科室提供咨詢，從而更好地服務于臨床研究和轉化研究。本研究對兒童專科醫院樣本庫近 5 年的樣本特征進行了分析，其結果為未來調整樣本庫管理策略提供決策支持。

3.1 樣本庫是臨床研究的資源平臺支撐，項目庫和戰略庫各有側重

從動態數據分析結果來看，項目庫和戰略庫在不同時期的占比不同。項目庫子庫是指樣本在入庫時研究目的明確、有科研項目支撐的樣本子庫；戰略庫子庫是指樣本在入庫時研究目的尚不明確、尚無科研項目支撐，但基于對該疾病已有的知識和待解決的診療問題、未來有可能申請項目支持該樣本的研究而戰略性采集和保藏疾病樣本建立的樣本子庫。在兒童專科醫院，一些罕見病的樣本常以戰略庫子庫的形式采集和保存樣本。在樣本庫運行的早期階段，由于樣本的重要性和如何科學地留取樣本在各臨床科室的認知度較低、對于如何利用樣本開展研究也認識不充分，因此，此階段的入庫病種以戰略庫子庫為主導地位。隨著樣本對于研究的重要性在各臨床科室的認知度逐漸提升，后期樣本庫里的項目庫子庫占比不斷提升。隨著近年來對臨床研究的重視，樣本的采集和保藏計劃也將納入臨床研究方案的規劃，項目庫子庫有望為臨床研究提供更好的資源管理平臺。

臨床研究是一項復雜的系統工程，其以患者為主要研究對象，對其疾病的診斷、治療、預后、病因和預防措施等進行研究，其目的是解決臨床中尚未解決的診療問題[12]。以往的臨床研究過程中的疾病樣本的管理及其質量尚有待重視，因為樣本的質量與研究結果的可重復性密切相關[6,13]，而樣本的質量問題不僅包括樣本本身的生物學質量評估，還包括在臨床研究設計之初的樣本采集計劃是否合理以及相關的臨床診療和隨訪信息是否完整。新頒布的《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》旨在支撐疾病樣本的合理采集與規范使用，隨著高質量臨床研究項目的開展，采集和保藏高質量生物樣本的項目庫子庫必將在未來的轉化研究中發揮越來越重要的作用。

3.2 出生缺陷疾病樣本是兒童專科醫院的特色與重點，活庫需要得到更多的關注

從分析結果來看，入庫樣本的病種以出生缺陷類為主。出生缺陷是環境與遺傳相互作用所致，無論是否有明顯的環境高危因素，基因是研究此類疾病的重點，如患兒的出生缺陷在其家族中有先證者，最好同時留取家系樣本。高通量分析在尋找出生缺陷病因研究中發揮了重要作用，如果與出生缺陷高度相關的基因變異被發現，需要利用合適的動物模型或細胞模型進行功能實驗，這種情況下，預先留取患兒的活細胞至關重要。

傳統的樣本庫里存儲的樣本大多以生物大分子、組織、體液等不能在體外培養和擴增的類型為主，我院的樣本也符合該特征。但由于這些樣本不能用來開展功能實驗，因此，近年來，生物樣本庫“活庫”日漸受到重視[1,8]。顧名思義，“活庫”的意思是樣本可在體外合適的條件下存活和擴增，包括細菌和真菌等病原體、體細胞、類器官、患者來源的異種移植物等，其各有研究優勢（表 1）。體細胞的優勢在于對體外培養條件的要求較低、易于開展基因功能實驗、細胞攜帶有患者的基因信息且能通過基因編輯建立較好的自身對照研究體系等。以本樣本庫的隱睪特異性 iPSCs 這一活細胞子庫為例，其以隱睪患兒的尿源性細胞為種子細胞，導入與多能性密切相關的四個關鍵的轉錄因子、使其重編程為具有胚胎干細胞特性的 iPSCs，利用其體外向生殖細胞的誘導分化過程進行與隱睪導致不育相關的機制研究[14]。類器官是指在體外對組織進行原代團塊樣培養，保持其與體內類似的結構與細胞間連接，從而最大限度地在體外模擬其體內的生理狀態用于研究[15]，來源于干細胞的類器官也可在體外動態培養中模擬體內發育過程。PDX 是腫瘤的個體化治療的良好的實驗模型，其將患者的小塊新鮮腫瘤組織移植于人源化的免疫缺陷小鼠的皮下或腎包膜下，建立患者來源的個體化的腫瘤模型，在動物活體中較好地保存了患者原發腫瘤的遺傳特性和異質性，具有獨特優勢[16]。我院樣本庫中兒童腫瘤的樣本僅次于出生缺陷疾病的樣本，但目前儲存的形式多以腫瘤組織和 DNA 為主，在此基礎上如能建立腫瘤組織來源的類器官或 PDX 模型，可為其將來的機制研究和個體化治療儲備寶貴資源。這些具有獨特研究價值的活體樣本是樣本庫未來的發展重點，然而，其對樣本庫的專業人員、硬件環境等要求較高，可能是當前尚未普及的重要原因之一，如能通過項目的支持和資源的調配，逐步建立來源于疾病個體的可再生的活體樣本，意義深遠。

表 1 常用的活體樣本類型及其優勢

3.3 根據兒童專科醫院的樣本特點，充分發揮樣本庫的支撐作用

從分析結果來看，我院生物樣本庫逐年穩步發展。隨著管理體系的日漸成熟，我院樣本庫早已從最初的建設階段進入了產出階段。經統計，我院樣本庫迄今已經支持了多個級別課題的立項，分別來自國家自然科學基金、上海市科委、上海市教委、上海市衛健委、上海交通大學醫學院等，并有多篇相關論著發表，內容涉及樣本庫的規范化管理與質量控制[10-11, 14, 17]以及多種疾病的相關臨床研究。

基于兒童專科醫院的特點，本文分析結果顯示在庫樣本疾病種類以出生缺陷類疾病及兒童腫瘤為主，與之相符，樣本庫所支撐的相關臨床研究亦聚焦于此，包括先天性巨結腸[18]、隱睪[19-20]等出生缺陷類疾病，神經母細胞瘤[21-22]等兒童腫瘤類疾病。此外，由于活庫的建立可幫助臨床研究者更全面地進行相關疾病的機制研究及推動個體化治療，因此我院對樣本庫活庫尤其是干細胞活庫的應用也逐漸增加，并已有相關論著發表[19, 23]。未來我院生物樣本庫將在現有基礎上，進一步完善管理體系，加強與臨床資料的對接，以促進轉化醫學研究，尤其關注兒童專科醫院特色病種，提升生物樣本庫對醫院學科和人才的支撐作用。

綜上所述，兒童專科醫院的樣本具有其獨特性，樣本庫應及時有效地調整運行策略，以更好地支持臨床研究，同時結合生命科學領域的進展，未來建立重要兒童疾病的活體樣本庫是必然的發展趨勢。

[1] Coppola L, Cianflone A, Grimaldi AM, et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med, 2019, 17(1):172.

[2] Harati MD, Williams RR, Movassaghi M, et al. An introduction to starting a biobank. Methods Mol Biol, 2019, 1897:7-16.

[3] Ji X, Wang M, Li L, et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreserv Biobank, 2017, 15(5):475-483.

[4] Wang M, Ji X, Wang B, et al. Simultaneous evaluation of the preservative effect of RNAlater on different tissues by biomolecular and histological analysi. Biopreserv Biobank, 2018, 16(6):426-433.

[5] Gao FF, Wang TT, Chi YJ, et al. Establishment of quality control system for non-alcoholic fatty liver biobank. Chin Med Biotechnol, 2017, 12(5):466-469. (in Chinese)

高芳芳, 王婷婷, 遲毓婧, 等. 非酒精性脂肪肝樣本庫質控體系的建立. 中國醫藥生物技術, 2017, 12(5):466-469.

[6] Bishop D. Rein in the four horsemen of irreproducibility. Nature, 2019, 568(7753):435.

[7] Giwa S, Lewis JK, Alvarez L, et al. The promise of organ and tissue preservation to transform medicine. Nat Biotechnol, 2017, 35(6):530- 542.

[8] Sachs N, de Ligt J, Kopper O, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell, 2018, 172(1-2):373- 386, e10.

[9] Wang M, Gao ZM, Lyu ZB, et al. Establishment and application of characteristic biobank in children's hospital. Chin Med Biotechnol, 2016, 11(3):280-284. (in Chinese)

王敏, 高志梅, 呂志寶, 等. 兒童專科醫院特色生物樣本庫的建立與應用. 中國醫藥生物技術, 2016, 11(3):280-284.

[10] Wu J, Gu YJ, Zhou JM. Establishment and application of "one disease one card" management system in biobank of our hospital. Chin J Hosp Adm, 2013, 29(11):866-867. (in Chinese)

吳靜, 顧怡珺, 周君梅. 我院生物樣本庫“一病一卡”管理制度的建立與應用. 中華醫院管理雜志, 2013, 29(11):866-867.

[11] Zhou JM, Zhang K. Analysis of the whole process quality control on the management of biobank. Chin J Med Sci Res Manag, 2017, 30(2):90-93. (in Chinese)

周君梅, 張勘. 院級生物樣本庫管理的全流程質量控制分析. 中華醫學科研管理雜志, 2017, 30(2):90-93.

[12] Grimes DA, Schulz KF. An overview of clinical research: the lay of the land. Lancet, 2002, 359(9300):57-61.

[13] Baker M, Dolgin E. Cancer reproducibility project releases first results. Nature, 2017, 541(7637):269-270.

[14] Zhou JM, Wang M, Zhang K, et al. Establishment of a whole process sample management system supporting high-quality translational research. Chin Med Biotechnol, 2019, 14(5):474-476. (in Chinese)

周君梅, 王敏, 張勘, 等. 支撐高質量轉化研究的臨床研究全流程樣本管理體系的建立. 中國醫藥生物技術, 2019, 14(5):474-476.

[15] Li M, Izpisua Belmonte JC. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med, 2019, 380(20):1982.

[16] Karamboulas C, Ailles L. Patient-derived xenografts: a promising resource for preclinical cancer research. Mol Cell Oncol, 2019, 6(1): 1558684.

[17] Gao Z, Gu Y, Lv Z, et al. Practical electronic information system and printed recording promote management accuracy in an early-stage small-scale non-automatic biobank. Biopreserv Biobank, 2015, 13(1): 61-66.

[18] Xu LC, Zhou JM, Li H, et al. Distribution of mast cells and its role in different phenotypes of Hirschsprung's disease. Chin J Pediatr Surg, 2014, 35(7):495-499. (in Chinese)

許靈蒼, 周君梅, 李會, 等. 肥大細胞在先天性巨結腸各表型中的分布及其作用. 中華小兒外科雜志, 2014, 35(7):495-499.

[19] Zhang YY, Chen F, Zhou JM, et al. In vitro differentiation of germ cell from human cryptorchid-specific induced pluripotent stem cells. Chin J Pediatr Surg, 2014, 35(5):329-332. (in Chinese)

張艷陽, 陳方, 周君梅, 等. 人隱睪特異性誘導多能性干細胞體外向生殖細胞定向分化的初步研究. 中華小兒外科雜志, 2014, 35(5): 329-332.

[20] Wang BJ, Zhou JM, Chen F, et al. Muscle components of gubernaculum testis from high/low cryptorchidic children. J Clin Pediatr Surg, 2019, 18(6):523-526, 528. (in Chinese)

王冰潔, 周君梅, 陳方, 等. 人類高低位隱睪睪丸引帶內肌肉組分的探究. 臨床小兒外科雜志, 2019, 18(6):523-526, 528.

[21] Wu W, Shao JB, Zhou JM, et al. The unduced effect of arsenic trioxide in different types of neuroblastoma cell lines. Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(15):1164-1167. (in Chinese)

吳偉, 邵靜波, 周君梅, 等. 三氧化二砷對3種神經母細胞瘤細胞株的誘導作用. 中華實用兒科臨床雜志, 2015, 30(15):1164-1167.

[22] Shao JB, Wu W, Li LL, et al. Study on 13-cis retinoic acid inducing differentiation of three types of human neuroblastoma cell lines in vitro. Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(15):1152-1156. (in Chinese)

邵靜波, 吳偉, 李玲玲, 等. 13-順式維甲酸體外誘導3種神經母細胞瘤細胞株分化研究. 中華實用兒科臨床雜志, 2015, 30(15):1152- 1156.

[23] Bao JW, Zhou JM, Chen F, et al. Multipotent differentiation of urine-derived stem cells and construction of multi-layer cell sheet with induced smooth muscle cells from urine-derived stem cells. Chin J Pediatr Surg, 2017, 38(12):920-926. (in Chinese)

包杰文, 周君梅, 陳方, 等. 尿源性干細胞多向誘導分化及誘導后平滑肌復層細胞膜片的構建. 中華小兒外科雜志, 2017, 38(12): 920-926.

·協會之窗·

2020 年 5 月，協會受杭州師范大學委托，對其開展的“瀕危珍稀中藥鐵皮石斛、霍山石斛人工繁育技術體系創建及產業化”項目進行科學技術成果評價。

為了順利完成此次評價工作，協會在杭州師范大學提交了科技成果函審表及成果相關證明材料，包括工作報告，研究報告，技術報告，發表的論文、論著、專利等技術資料的基礎上，組織相關領域專家組成評審專家組函審評價。

該項評價工作歷時一個月。由陳凱先院士領銜的專家評審組，包含生物技術、中醫中藥和醫藥學等領域的院士和專家，向協會提交了上述成果的獨立評價意見。在專家獨立評價的基礎上，陳凱先院士作為專家組組長，最終提交了函審綜合意見、綜合評分與評價結論。

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.004

上海市衛生健康委員會衛生行業臨床研究專項（201940204）；上海交通大學轉化醫學協同創新中心合作研究項目（TM201827）；上海交通大學醫學院轉化醫學創新基金（15ZH4008）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2019-12-16