腫瘤基因突變檢測的標準化研究

張文新，黃傳峰，孫楠，高飛，胡澤斌，孫晶，黃杰，曲守方

·論著·

腫瘤基因突變檢測的標準化研究

張文新*，黃傳峰*，孫楠，高飛，胡澤斌，孫晶，黃杰，曲守方

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室（張文新、孫楠、高飛、胡澤斌、孫晶、黃杰、曲守方）；理化檢測室（黃傳峰）

探索制備和等腫瘤基因突變參考品的方法，用于評價腫瘤基因突變檢測試劑盒（二代測序法）的性能。

收集和等基因突變的組織切片和細胞系，提取樣本的 DNA 和 RNA。采用數(shù)字 PCR 方法對樣本對應(yīng)的基因突變進行驗證和定量，確定陽性參考品及其突變比例；然后將陽性參考品和野生型樣本混合，稀釋至突變率為 5% 和含 100 個融合 RNA 拷貝數(shù)的樣本，經(jīng)數(shù)字 PCR 定量后，作為檢測限參考品。采用腫瘤基因突變檢測試劑盒（二代測序法）進行準確性和檢測限項目檢測。

數(shù)字 PCR 的結(jié)果表明成功制備了陽性參考品和檢測限參考品，并確定其突變比例；制備的參考品能被腫瘤基因突變檢測試劑盒（二代測序法）正確檢出。

建立了制備腫瘤基因突變參考品的方法，制備的參考品可以用于評價腫瘤基因突變檢測試劑盒（二代測序法）的性能。

靶向藥物； 分子靶向治療； 基因突變； 下一代測序； 標準物質(zhì)研究

腫瘤驅(qū)動基因3等是細胞分化、增殖、凋亡、遷移等過程中關(guān)鍵的基因，這些基因突變會持續(xù)激活相關(guān)信號通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。隨著這些基因被不斷發(fā)現(xiàn)，針對特定分子靶點的藥物研究進展迅速，包括表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）和棘皮動物微管相關(guān)樣蛋白-4-間變性淋巴瘤激酶（EML4-ALK）融合基因抑制劑（TKI）等[3]。檢測這些相關(guān)基因是否發(fā)生突變或者融合，確定腫瘤患者的藥物敏感性，可以為臨床醫(yī)生選擇個體化靶向藥物治療提供參考。

傳統(tǒng)的腫瘤突變檢測方法包括免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交、熒光聚合酶鏈反應(yīng)法和 sanger 測序法等[4-6]。這些腫瘤突變檢測方法的局限性在于每次只能檢測一種基因，而且根據(jù)檢測基因數(shù)量的增多需要更多的活檢組織。隨著精準醫(yī)療和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）在腫瘤基因檢測方面得到廣泛的應(yīng)用，可以在同一份活檢組織中一次檢測多個基因突變，包括點突變、插入、缺失、DNA 拷貝數(shù)改變及重排（融合）等多種突變形式[7-9]。本研究擬探索建立一種制備腫瘤基因突變參考品的方法，制備的參考品能夠用于評價基于二代測序技術(shù)平臺的腫瘤基因突變檢測試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株購自美國菌種保藏中心（ATCC）。選取石蠟包埋組織樣本，包括不同腫瘤基因的突變類型。

1.1.2 試劑 AllPrep DNA/RNA FFPE Kit 購自美國 Qiagen 公司；DNA/RNA 共提取試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限責任公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit、Qubit?RNA HS Assay Kit、QuantStudio? 3D Digital PCR Master Mix v2 和TaqMan?Gene Expression Assay 購自美國 Life Technologies 公司；One-Step RT ddPCR Advanced Kit for Probes 購自美國 Bio-Rad 公司；人、、、3、、1 基因突變檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）購自天津諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本 DNA 和 RNA 的提取 選擇石蠟包埋組織樣本（FFPE）蠟卷片放入 1.5 ml 離心管中，進行脫蠟處理后，按照 AllPrep DNA/RNA FFPE Kit 說明書提取樣本的 DNA 和 RNA。將野生型細胞株、正常人白細胞和帶有腫瘤基因突變的細胞株，按照 DNA/RNA 共提取試劑盒說明書進行DNA和RNA 提取。使用 Qubit?3.0 進行樣本DNA/RNA 定量。

1.2.2 陽性參考品突變比例確定 按照 3D 數(shù)字 PCR 檢測流程，配制反應(yīng)體系：含 10 ng DNA 樣本 6.75 μl，2× QuantStudio? 3D Digital PCR Master Mix 0.75 μl，20× Taqman ASSAY（primer/probe mix）0.75 μl，加雙蒸水補足至 15 μl。取 14.5 μl 配置好的體系加入到加樣孔，反應(yīng)液均勻涂抹到芯片上。將芯片放置在平板 PCR 儀上，按照如下程序進行 PCR 反應(yīng)：96 ℃ 10 min；56 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39 個循環(huán)；56 ℃ 2 min，10 ℃保存。將芯片放入芯片讀取儀進行讀取。使用 QuantStudio 3D Analysis Suite 軟件分析結(jié)果。將突變陽性的樣本 DNA 作為待測樣本，檢測腫瘤基因的原始突變比例，將其作為陽性參考品。根據(jù)原始突變比例，將陽性參考品 DNA 和野生型 DNA 進行混合，制備 5% 突變比例的檢測限參考品，然后經(jīng) 3D 數(shù)字 PCR 驗證。

按照伯樂數(shù)字 PCR 檢測流程 One-Step RT ddPCR Advanced Kit for Probes 試劑盒配制反應(yīng)體系：含 30 ng RNA 樣本 11 μl，Super Mix 5 μl，Reverse transcriptase 2 μl，300 mmol/L DTT 1 μl，20 × Taqman assay（probe mix）1 μl。轉(zhuǎn)移 20 μl 反應(yīng)體系至 DG8 cartridge，放入微滴生成儀生成微滴，轉(zhuǎn)移到 96 孔板，用 PX1 熱封儀進行封膜。封好的 96 孔板放入 PCR 儀中進行擴增，反應(yīng)程序如下：45 ℃ 60 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；98 ℃ 10 min。將 96 孔板放入 QX200 Droplet Reader 儀器中，使用 QuantaSoft 軟件進行分析。將融合突變陽性的樣本 RNA 作為待測樣本，檢測后獲得融合 RNA 拷貝數(shù)，將其作為陽性參考品。將陽性參考品 RNA 和野生型 RNA 混合，制備每 30 ng RNA 含 100 個融合 RNA 拷貝數(shù)的檢測限參考品，然后經(jīng)伯樂數(shù)字 PCR 驗證。

1.2.3 文庫的構(gòu)建和定量 將制備的陽性參考品和檢測限參考品，按照人、、、3、、1 基因突變檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）的說明書構(gòu)建文庫，步驟包括：RNA 樣本的反轉(zhuǎn)錄，目的片段的 PCR 擴增，引物的消化，加 P1 接頭和特異性接頭以及文庫的純化。

然后采用熒光定量 PCR 儀將文庫進行定量。根據(jù)文庫濃度，分別將 DNA 文庫和 RNA 文庫稀釋至 100 pmol/L 和 50 pmol/L，然后將所有的DNA 文庫和 RNA 文庫等體積混合，再將 4.8 μl 混合后的 DNA 文庫和 2.4 μl 混合后的 RNA 文庫混合后，進行模板制備。

1.2.4 模板的制備和富集 文庫混合后進行乳液 PCR 擴增。將配制好的乳液 PCR 反應(yīng)液和模板反應(yīng)油注入到模板制備過濾器，裝入 Ion OneTouchTM2儀器上選擇程序進行反應(yīng)，步驟包括：通過反應(yīng)器形成油包水型，PCR 擴增反應(yīng)，離心回收制備好的模板。然后用 Ion OneTouchTMES 的磁珠技術(shù)進行模板富集。

1.2.5 測序 將質(zhì)控模板加入到富集的模板溶液中，退火，將混合液加入到測序芯片，加測序酶。將芯片上機進行測序。用癌癥基因數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 陽性參考品和檢測限參考品驗證結(jié)果

腫瘤組織來源的 DNA 樣本 PD1 在 3D 數(shù)字 PCR 的結(jié)果為基因 18 外顯子突變陽性，且突變比例為10.1%，見圖 1A。將其稀釋至理論突變比例為 5% 的 DNA 樣本 LD1，結(jié)果表明也為突變陽性，而且突變比例為5.9%，見圖 1B。3D 數(shù)字 PCR 的驗證結(jié)果表明，成功制備了 DNA 樣本的陽性參考品 PD1 和檢測限參考品 LD1。

細胞株來源的 RNA 樣本 PR1 在伯樂數(shù)字 PCR 的結(jié)果為 EML4-ALK 融合突變陽性，且融合突變濃度為 768 拷貝/μl，見圖 2A。將其稀釋至理論融合突變濃度為 5 拷貝/μl 的樣本 LR1，結(jié)果表明也為融合突變陽性，且融合突變濃度為 4.7 拷貝/μl，即 20 μl 反應(yīng)體系中含有 94 個拷貝的融合 RNA，見圖 2B。伯樂數(shù)字 PCR 的驗證結(jié)果表明成功建立了 RNA 樣本的陽性參考品 PR1 和檢測限參考品 LR1。

2.2 測序結(jié)果

使用人、、、3、、1 基因突變檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）進行檢測，利用癌癥基因數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到了樣本的變異信息。陽性參考品和檢測限參考品的腫瘤基因突變類型的結(jié)果均與數(shù)字 PCR 的結(jié)果一致。測序結(jié)果顯示，陽性參考品 PD1 在 7 號染色體的 55241708 位置處發(fā)生了鳥嘌呤 G 突變?yōu)榘奏?C，支持突變的 reads 數(shù)為 474，經(jīng)過與人類基因組（hg19）比對，結(jié)果是基因 18 外顯子的 G719A 突變；陽性參考品 PR1 比對到參考序列上的 reads 數(shù)是 1520542，支持突變的 reads 數(shù)是 303249，經(jīng)過與參考序列比對，結(jié)果是 EML4-ALK E13A20 融合形式；檢測限參考品的測序結(jié)果也符合陽性參考品的突變類型（表 1 和表 2）。

圖 1 DNA 陽性參考品和檢測限參考品的 3D 數(shù)字 PCR 結(jié)果（A：陽性參考品 PD1；B：檢測限參考品 LD1）

Figure 1 The results of DNA positive and limit reference material by QuantStudio 3D digital PCR (A:PD1 positive reference;B:LD1 limit detection reference)

A B

Figure 2 The results of RNA positive and limit reference material by Bio-Rad droplet digital PCR (A: PR1 positive reference;B: LR1 limit detection reference)

表 1 DNA 樣本的陽性參考品和檢測限參考品的測序結(jié)果

表 2 RNA 樣本的陽性參考品和檢測限參考品的測序結(jié)果

3 討論

隨著精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展，針對新的驅(qū)動基因的靶向治療藥物迅速發(fā)展。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已經(jīng)批準了表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑——吉非替尼和奧西替尼等和間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑——克唑替尼等[10-11]。這些靶向治療藥物均對攜帶某些特定基因變異的人群有效，因此其分子腫瘤伴隨診斷具有十分重要意義。

是最常見的驅(qū)動基因，在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中高度表達。2004 年，Lynch 等[12]首次提出，TKI 對不同 NSCLC 的治療效果的差異是由于 EGFR 外顯子的突變狀態(tài)不同。EGFR 19 外顯子缺失突變（以 delE746-A750 為主要代表）及 21 外顯子 L858R 點突變的非小細胞肺癌患者對 EGFR-TKI 治療敏感。EML4-ALK 基因融合是新發(fā)現(xiàn)的致癌驅(qū)動基因[13]，已從肺癌患者中發(fā)現(xiàn)了 10 多種不同的融合基因型，比例占到肺癌人群的 3% ~ 7%。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）非小細胞肺癌（NSCLC）臨床實踐指南（2014 版）提出，對于腺癌、大細胞癌以及未分類的 NSCLC，常規(guī)進行表皮生長因子受體（EGFR）基因突變和 EMIA-ALK 融合基因檢查，若 EGFR 突變陽性則選擇 EGFR TKI 治療如厄洛替尼，EML4-ALK 融合基因陽性者，可給予 ALK 小分子抑制劑克唑替尼治療。因此提高腫瘤基因突變檢測的敏感性和準確性，有助于改善 NSCLC 患者治療。

與傳統(tǒng)的 FISH 及熒光 PCR 法相比，高通量測序具有較高的靈敏度和準確度。國內(nèi)已經(jīng)開展研發(fā)對肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的基于 NGS 技術(shù)的體外診斷試劑盒。體外診斷試劑產(chǎn)品質(zhì)量的提高有賴于國家標準物質(zhì)水平的提高和完善[14-15]。為了配合新的檢測技術(shù)，應(yīng)該建立基于二代測序技術(shù)檢測的腫瘤基因突變國家參考品。建立腫瘤基因突變參考品的關(guān)鍵在于確定樣本的腫瘤基因突變比例。數(shù)字 PCR 技術(shù)具有極高的敏感性，是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相比于傳統(tǒng)的熒光定量 PCR 技術(shù)，數(shù)字 PCR 技術(shù)能夠直接讀出 DNA 和 RNA 分子的拷貝數(shù)。從檢測突變頻率的角度考慮，數(shù)字 PCR 技術(shù)能夠檢測到萬分之一的基因突變。本研究探索了建立腫瘤基因突變參考品的方法，選用 3D 數(shù)字 PCR 和伯樂數(shù)字 PCR 對發(fā)生突變或者融合突變的組織樣本和細胞株進行驗證，確定腫瘤基因的突變比例，制備了陽性參考品和檢測限參考品。研究結(jié)果表明腫瘤基因突變參考品的建立方法是可靠的，制備的參考品評價了基于 NGS 平臺的腫瘤基因突變檢測試劑盒的性能，完成了該類試劑盒的標準化研究工作，也為國家參考品的建立提供了技術(shù)指導(dǎo)。

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·學(xué)術(shù)活動預(yù)告·

中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會移植技術(shù)分會（以下簡稱“移植技術(shù)分會”）于 2019 年 10 月 27 日在武漢成立，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院器官移植研究所陳剛教授為第一屆主任委員，現(xiàn)有 72 名委員。移植技術(shù)分會是一個為臨床醫(yī)生、科研人員和生產(chǎn)企業(yè)提供多方交流與合作，注重產(chǎn)學(xué)研結(jié)合、促進新技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化的平臺。各位委員已經(jīng)開始規(guī)劃通過高質(zhì)量臨床研究，促進移植相關(guān)檢測及治療技術(shù)的最優(yōu)化和標準化，推動新技術(shù)和新產(chǎn)品應(yīng)用轉(zhuǎn)化，制訂或完善行業(yè)規(guī)范和標準，以更好地為患者服務(wù)。

在我國抗擊新冠疫情取得階段性成果之際，為了加強技術(shù)與臨床的交流，推動移植技術(shù)的發(fā)展和完善臨床診療方案，由中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會移植技術(shù)分會主辦，國藥集團東風總醫(yī)院承辦的“第一屆中國移植技術(shù)高峰論壇暨 2020 年中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會移植技術(shù)分會工作會議”將于 2020 年 9 月 25 – 26 日在湖北省十堰市召開。本次會議的主題是“移植延續(xù)生命技術(shù)成就夢想”，會議將圍繞器官移植臨床與技術(shù)前沿，邀請國內(nèi)外知名專家參與大會學(xué)術(shù)交流。

會議詳情及報名請登錄中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會網(wǎng)站https://www.bagevent.com/event/6628908 查閱。

Study on the standardization of tumor gene mutation detection

ZHANG Wen-xin, HUANG Chuan-feng,SUNNan,GAO Fei, HU Ze-bin, SUN Jing, HUANG Jie, QU Shou-fang

Division of Diagnostic for Non-infectious Disease (ZHANG Wen-xin, SUN Nan, GAO Fei, HU Ze-bin, SUN Jing, HUANG Jie, QU Shou-fang), Division of Physical and Chemical Testing (HUANG Chuan-feng), National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

To explore the method for preparing the reference material for human tumor gene such asandfusion gene in order to evaluate the performance of tumor gene mutation detection kit (next-generation sequencing, NGS).

Different tissue sections and cell lines including these gene mutations were collected and DNA and RNA of samples were extracted. The genetic mutation corresponding to the sample was verified and quantified by digital PCR method to determine the positive control material and its mutation frequency. Then positive reference material of DNA or RNA and wild type samples were mixed to dilute them to a sample with a mutation rate of 5% and a number of 100 fusion RNA copies after being quantified by digital PCR as a test limit reference. The accuracy and detection limit was carried out by using tumor gene mutation detection kit (NGS).

The results of digital PCR method showed that positive and limit reference material were successfully established, and their mutation frequency were determined. The reference materialcould be correctly detected by kit (NGS).

The preparation method ofreference material is establishedand it could be used for evaluating the performance of tumor gene mutation detection kit (NGS).

Targeted drug; Molecular targeted therapy; Gene mutation; Next generation sequencing; Research on reference material

QU Shou-fang, Email: qushoufang@126.com; HUANG Jie, Email: jhuang5522@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.04.010

曲守方，Email：qushoufang@126.com；黃杰，Email：jhuang5522@126.com

2020-02-12

*同為第一作者