縊蟶酶解工藝優化及氨基酸分析研究

晉文慧，陳暉，洪專

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361005)

縊蟶(SinonovaculaconstrictaLamarck)隸屬軟體動物門、瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、竹蟶科，又名蟶子，廣泛分布于中國、日本和朝鮮等國的沿海地區。縊蟶是我國四大養殖貝類之一，其肉質豐腴脆嫩，鮮美清甜，還具有補虛、止痢之功效，深受人們的喜愛[1]。福建是全國的養蟶大省，養殖產量常年位居全國前列。2018年福建省蟶類養殖總面積達到13407公頃，產量達到279485噸，約占全國的1/3。縊蟶中含有豐富的氨基酸、短肽、核苷酸、有機酸等多種呈味物質，是作為天然水產調味品的良好原料[2]。特別是其中的游離氨基酸，對水產食品新鮮度的評價和風味的貢獻有非常重要的作用。如丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸都會影響其風味和口感，丙氨酸和谷氨酸具有甜味等，而精氨酸等其他游離氨基酸對貝類鮮味風味也起到重要作用[3,4]。目前，關于縊蟶的研究主要集中在養殖和粗加工方面，而深加工特別是綜合開發方面的研究卻很少，大量的縊蟶資源沒有得到很好的開發和利用。隨著社會經濟的高速發展，人們對于生活質量的要求也越來越高，調味品也越來越多樣化。通過酶解或者美拉德反應等開發新型水產調味品[5-9]，不僅能夠滿足現代人對生活品質的要求，而且能夠對水產品資源進行深度加工，提高低值原料的附加值，將會產生顯著的社會效益和經濟效益[10-13]。本研究以縊蟶肉為原料，通過選用適當的蛋白酶水解，提高酶解液中呈味物質的含量。通過單因素、正交實驗、雙酶復合等方式優化酶解工藝條件，采用離子色譜法測定縊蟶酶解液中游離氨基酸的含量，確定了最佳工藝參數。本研究成果為縊蟶天然調味品的開發提供了數據基礎和理論依據，將能促進水產加工及調味品行業的持續健康發展。

1 材料與方法

1.1 原料

縊蟶：購于廈門市翔安區農貿市場；胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶等：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；諾維信蛋白酶 Protamex：諾維信(中國)生物技術有限公司；醋酸鈉、氫氧化鈉：色譜純，美國Thermo Fisher公司；氨基酸混合標準溶液：色譜純，美國Sigma公司；其他所用試劑：均為國產分析純。

1.2 主要儀器設備

ICS-5000離子色譜儀 美國Thermo公司；ET18自動電位滴定儀 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理

縊蟶開殼取肉后清洗干凈，瀝干水分，放入組織搗碎機中打成泥漿備用。稱取一定量搗碎后的肉泥，按照料水比1∶1加入水，根據實驗設計加入不同量的酶，分散后調節pH，放入水浴鍋中，于相應溫度下進行酶解。經一定時間后，滅酶(80 ℃，30 min)，冷卻，轉移到離心管中離心(20000 r/min，20 min)，取上清液。

1.3.2 酶解

用酶對食品行業中常用的胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、諾維信蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶等進行篩選，根據文獻[14,15]設計各酶的最適水解條件，以呈味核苷酸二鈉、氨基酸態氮為指標，對7種酶的酶解效果進行篩選。

1.3.3 單因素實驗

篩選出合適的酶后，以氨基酸態氮、呈味核苷酸二鈉為指標，對影響酶解的時間、溫度、酶用量、pH等因素進行比較研究。

1.3.4 正交實驗

在單因素實驗基礎上，選用L9(33)正交實驗對酶添加量、pH、酶解溫度等參數進行進一步優化。

1.3.5 復合酶解實驗

在最佳用酶篩選實驗和單因素實驗的基礎上，選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶進行復合，分別按中性蛋白酶∶諾維信蛋白酶為1∶1、2∶1、1∶2的比例進行進一步優化。

1.3.6 氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的測定

氨基酸態氮含量的測定：參照GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》[16]；呈味核苷酸二鈉含量的測定：參照GB 1886.171-2016《食品安全國家標準 食品添加劑5′-呈味核苷酸二鈉(又名呈味核苷酸二鈉)》[17]。

1.3.7 游離氨基酸含量的測定

吸取酶解液100 μL置于5 mL離心管中，加入300 μL無水乙醇混勻后，10000 r/min離心5 min，取上層清液用氮吹儀吹干，加水1 mL復溶，過濾后采用離子色譜儀進行分析。

測試條件：色譜柱：Thermo AminoPac PA-10(2 mm×250 mm，10 μm)；流速：0.24 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 氨基酸測定梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for amino acids analysis

根據氨基酸標準物質的保留時間和峰面積，采用外標法對縊蟶酶解液中游離氨基酸組成及含量進行分析，單位以μmol/L表示。

2 結果與分析

2.1 縊蟶的最佳用酶篩選

各酶的酶解條件見表2，酶解后氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉的含量測定結果見圖1。

表2 不同酶的酶解條件Table 2 Hydrolysis conditions of different enzymes

圖1 酶種類的篩選Fig.1 The screening of enzyme species

由圖1可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶和諾維信蛋白酶酶解縊蟶后，酶解液中氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉的含量都較高，但是由于在酶解過程中堿性蛋白酶和胰酶的氣味較刺鼻，故選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶為縊蟶酶解最佳用酶。以中性蛋白酶為例，對影響酶解的時間、溫度、酶用量、pH等因素進行了比較研究。

2.2 單因素實驗

2.2.1 時間對酶解效果的影響

中性蛋白酶在酶解溫度50 ℃、酶用量0.2%、pH 7的條件下，分別設置酶解時間為0，0.5，1，2，4，6，8 h，考察酶解液中氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的變化情況，結果見圖2。

圖2 時間對酶解的影響Fig.2 Effect of time on the hydrolysis

由圖2可知，隨著酶解時間延長，酶解液中氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量也隨之增加。酶解液中氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的增加速度隨著時間的延長而降低，當酶解時間達到6 h后，這兩種呈味物質的含量趨于平緩。這是因為蛋白分子上的酶作用位點隨著時間的延長而逐漸減少，同時酶解產物的累積抑制酶促反應的進行。因此，選擇適宜的酶解時間為6 h。

2.2.2 溫度對酶解效果的影響

中性蛋白酶在酶用量0.2%、pH 7、酶解時間6 h的條件下，分別考察酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃對酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結果見圖3。

圖3 溫度對酶解的影響Fig.3 Effect of temperature on the hydrolysis

由圖3可知，當酶解溫度低于50 ℃時，酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量隨著溫度升高顯著增大，當溫度為50 ℃時，酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量達到最大，此時再升高溫度，酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量降低。可見，在酶解過程中，隨著酶解溫度的升高，酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量呈現先升高后下降的趨勢，在50 ℃時達到最高。酶解溫度過低或過高時，蛋白酶的活性受到抑制，適當提高溫度可增加酶的活力；但當溫度過高時，酶受熱使其構像被破壞，酶的穩定性下降，酶解效率也隨之降低。當酶解溫度趨近酶解最適溫度時，酶解效率最高，因此中性蛋白酶的最適酶解溫度為50 ℃。

2.2.3 酶用量對酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、pH 7、酶解時間6 h的條件下，分別考察酶用量為0.1%、0.2%、0.5%、1%對酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結果見圖4。

圖4 酶用量對酶解的影響Fig.4 Effect of enzyme additive amount on the hydrolysis

由圖4可知，當酶用量增加時，底物水解反應逐漸增強，蛋白質水解程度加大，酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量升高，酶用量超過0.2%時，增加速度較小。當酶濃度達到一定值時，再增加酶濃度難以促進水解反應。因此，適宜的酶用量為0.2%。考慮到實際應用中的生產成本問題，將后續正交實驗中的酶添加量控制在0.2%以下。

2.2.4 pH對酶解效果的影響

在不同pH下，蛋白質的解離程度不同，所以酶解的效果也不盡相同。中性蛋白酶在酶添加量0.2%、酶解溫度50 ℃、酶解時間6 h的條件下，分別考察初始pH為5，6，7，8，9對酶解液氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉含量的影響，結果見圖5。

圖5 pH對酶解的影響Fig.5 Effect of pH values on the hydrolysis

由圖5可知，pH過高或過低，均不利于氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉等呈味物質的釋放，中性蛋白酶對縊蟶的最適酶解pH為7。

2.3 正交實驗

綜合單因素實驗結果，選擇酶解溫度、酶添加量、酶解pH為考察因素，以縊蟶酶解中氨基酸態氮含量為指標，分別對中性蛋白酶和諾維信蛋白酶設計三因素三水平正交實驗來尋求最優工藝參數。實驗設計和結果見表3和表4。

表3 中性蛋白酶正交實驗設計方案與結果Table 3 The orthogonal experiment design and results of neutral protease

表4 諾維信蛋白酶正交實驗設計方案與結果Table 4 The orthogonal experiment design and results of novozyme protease

由方差分析中極差R值大小可知，中性蛋白酶和諾維信蛋白酶各因素對氨基酸態氮含量的影響順序大小都為：酶添加量>初始pH>酶解溫度，結果是一致的。對各因素進行直觀分析，中性蛋白酶添加量：K1>K2>K3；諾維信蛋白酶添加量：K1>K3>K2；中性蛋白酶和諾維信蛋白酶溫度均為：K2>K3>K1；中性蛋白酶pH：K2>K1>K3，諾維信蛋白酶pH：K1>K3>K2。綜上所述，中性蛋白酶酶解縊蟶最佳配比組合確定為A1B2C2，即溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，pH為7時酶解效果最佳。諾維信蛋白酶酶解縊蟶最佳配比組合確定為A1B2C1，即溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，pH為6.5時酶解效果最佳。在此最佳配比組合下，酶解液澄清透明,色澤金黃，甜咸適度，無腥味，具有良好的縊蟶特征風味。

2.4 復合酶解實驗

在正交實驗的基礎上，將中性蛋白酶和諾維信蛋白酶按2∶1、1∶1、1∶2的比例進行復合，在最優條件下(pH 6.5)對縊蟶進行酶解，與單酶在最優條件下的酶解效果進行對比，篩選最優的酶復合比例，結果見圖6。

圖6 不同比例復合酶的酶解效果Fig.6 Hydrolysis effect of compound enzymes with different proportions

由圖6可知，在不同的復合比例下，復合酶酶解液中氨基酸態氮及呈味核苷酸二鈉的含量均比單酶酶解后要高，其中又以中性蛋白酶和諾維信蛋白酶按1∶1進行復合時酶解效率最高。對酶解前后溶液中的游離氨基酸組成及含量進行檢測，結果見表5。

表5 酶解前后溶液中游離氨基酸的組成及其含量Table 5 Composition and content of free amino acids in solution before and after enzymatic hydrolysis μmol/L

由表5可知，用離子色譜法分析縊蟶酶解液中的氨基酸，共檢測出17種氨基酸,其中含有8種必需氨基酸，必需氨基酸約占氨基酸總量的61%。中性蛋白酶酶解后得到的游離氨基酸總量為1205.34 μmol/L，諾維信蛋白酶酶解后得到的游離氨基酸總量為946.5 μmol/L，而酶解前游離氨基酸總量為826.38 μmol/L，游離氨基酸含量比酶解前明顯增多，部分氨基酸達到酶解前的2倍之多。酶解后溶液中游離氨基酸和谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸等幾種呈味氨基酸的總量均有明顯增加，甘氨酸含量相對較高, 使水解液呈現較強的鮮味。其中中性蛋白酶酶解后游離氨基酸和呈味氨基酸的增加量較諾維信蛋白酶多，呈味氨基酸所占的比例也更高，從酶解前的34.46%升高到38.01%。雖然二者的氨基酸態氮含量接近，但中性蛋白酶水解產物具有更好的風味。在復合酶的水解中，精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和組氨酸的含量均顯著高于單酶酶解時的含量，而精氨酸和甘氨酸是除谷氨酸外對海鮮味產生重要作用的氨基酸，甘氨酸和絲氨酸有柔和的甜味，可以顯著增加酶解液的風味[18,19]。總之，復合酶解產生的游離氨基酸、呈味氨基酸以及呈味氨基酸的比例均比單酶進一步升高，而復合酶又以二者比例為1∶1時達到最高值1284.63 μmol/L，呈味氨基酸的比例增至38.74%，酶解后的縊蟶中各類氨基酸的含量出現了較大的增長，氨基酸總量相比酶解前增加了1.55倍，其中呈味氨基酸增加了1.75倍。結果表明，這一比例的復合酶酶解縊蟶能夠產生最佳的風味。

3 結論

本文選擇了食品行業中常用的幾種酶對縊蟶進行酶解，綜合考慮了氨基酸態氮和呈味核苷酸二鈉的含量以及酶解液的氣味，選擇中性蛋白酶和諾維信蛋白酶為最佳用酶。對中性蛋白酶酶解時間、酶解溫度、酶用量、pH等酶解條件進行了研究，初步確定了最適酶解條件。采用三因素三水平的正交實驗對酶解條件進行了優化，最終確定了中性蛋白酶的最佳酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，酶解pH為7，諾維信蛋白酶的最佳酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.2%，酶解pH為6.5。對兩種酶復合后酶解縊蟶的效果也進行了比較，并采用離子色譜法檢測了游離氨基酸的含量，結果顯示：在設定的復合比例下，復合酶酶解效果均優于單酶，游離氨基總量、呈味氨基酸總量以及呈味氨基酸的比例均有所增加，其中又以1∶1復合效果最好，表明此兩種酶在酶解縊蟶時具有很好的協調增效作用，能夠酶解縊蟶產生最佳的風味。本研究成果為縊蟶天然調味品的開發提供了數據基礎和理論依據。