響應面法優化藏藥蕨麻總生物堿提取工藝及其抗氧化研究

董 浩，李軍喬，王雅瓊，石子林

(1.青海民族大學生態環境與資源學院，中國 西寧 810007；2.青藏高原蕨麻研究中心，中國 西寧 810007)

蕨麻(PotentillaanserinaL.)，又名人參果，是薔薇科委陵菜屬多年生草本。根向地下延長，是一種典型的匍匐莖克隆植物。蕨麻根纖細，在秋冬季蕨麻會在根的下部長成紡錘形或橢圓形塊根[1]。蕨麻是一種具有良好藥用價值的植物，根據《四部醫典》[2]、《月王藥診》[3]、《藏藥志》[4]、《中國藏藥》[5]等記載，有收斂止血、止咳利痰、益氣補血、生津利痰等功效。在民間蕨麻也常被作為食品使用。蕨麻體內含有多種化學成分，如多糖、萜類、黃酮類、生物堿類化合物[6]。其中關于蕨麻黃酮類化合物、多糖類化合物、皂苷類化合物的提取工藝和含量已有較多的研究報道[7-11]。生物堿是一類含氮的堿性有機化合物，是中草藥的有效成分之一，具有鎮痛、止咳、消炎、平喘、抗菌的藥理活性[12]。目前國內外對蕨麻生物堿提取工藝和蕨麻生物堿含量研究未見報道。本研究擬采用響應面法優化乙醇回流提取蕨麻總生物堿工藝[13-16]，并以酸性染料比色法測定蕨麻總生物堿含量[17-19]，為進一步開發利用蕨麻總生物堿提供理論依據。

1 材料方法

1.1 材料

2019年7月采自青海省湟中縣日月鄉試驗田的青海蕨麻3號地上部分(經前期試驗比較青海蕨麻1號、2號、3號地上部分，選取藥用成分含量較高的青海蕨麻3號為本次試驗材料。青海蕨麻1號、2號、3號均為青藏高原蕨麻研究中心審定的我國獨有的蕨麻品種)。此時蕨麻正處于盛花期，經項目組前期研究表明蕨麻盛花期是蕨麻體內代謝物含量最為豐富的時期。將采集到的樣品陰干，待完全干燥后，用XFB-400高速中藥粉碎機粉碎，過0.42 mm篩后收集備用。

1.2 蕨麻總生物堿的提取

精密稱取樣品2 g，加入90%乙醇60 mL，75 ℃回流提取75 min后抽濾，加入20 mL乙醇沖洗濾餅，收集濾液，吸取10 mL提取液，加入20 mL 1%鹽酸酸化，過濾，加10 mL 1%鹽酸沖洗濾紙，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液調節pH=13。全部轉移到100 mL分液漏斗，并加入30 mL氯仿萃取，靜置30 min，收集氯仿層得供試品溶液。

1.3 蕨麻總生物堿含量的測定

精密量取供試品溶液0.5 mL，加入分液漏斗，加入4.5 mL 1%酸性乙醇，加入5 mL緩沖液和2 mL指示液，搖勻靜置1 min，加入10 mL氯仿，搖勻靜置30 min，去氯仿層。以氯仿為空白，測定吸光度，代入標準曲線中計算蕨麻總生物堿含量。

1.4 單因素試驗

蕨麻總生物堿提取工藝選擇提取時間、提取溫度、溶劑濃度、料液比等因素進行考察。

在其他因素不變的條件下，提取時間設置為30，45，60，75及90 min；選擇溫度分別為70，75，80，85及90 ℃；乙醇體積分數設定為70%，75%，80%，85%及90%；料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40及1∶50，提取液按1.3中方法進行處理，測定總生物堿含量。

1.5 響應面法優化提取工藝設計

根據單因素試驗結果，選擇提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇濃度(C)、料液比(D)作為考察因素，采用四因素三水平進行響應面實驗設計，見表1。

表1 試驗因素與水平Tab. 1 Test factors and levels

1.6 驗證試驗

使用響應面軟件Box-Behnken等分析得到優化的提取條件為時間74.93 min、溫度75 ℃、乙醇體積分數90%、料液比1∶30。考慮到試驗實際情況將提取時間修正為75 min，其它條件不變。

精密稱取5份各2 g樣品，按照修正后提取工藝條件提取總生物堿，按照1.2中實驗步驟處理提取液的供試品溶液，按照1.3中實驗步驟處理供試品溶液并測定吸光度，計算蕨麻總生物堿含量。

1.7 蕨麻總生物堿抗氧化試驗

1.7.1 總生物堿對DPPH清除率的測定 以95%乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，分別在具塞試管中配制2 mL質量濃度為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1總生物堿樣品溶液，分別加入2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH溶液，搖勻，室溫避光反應30 min，在517 nm處測定光度值，計算清除率。配制0，0.02，0.04，0.06，0.08及0.10 g·L-1的維生素C溶液作為陽性對照。樣品對DPPH的清除率E=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%(A樣品為樣品加入DPPH后吸光度，A對照為無水乙醇和樣品混合后吸光度，A空白為未加樣的DPPH溶液吸光度)。

1.7.2 總生物堿對ABTS清除率的測定 用純水配制7.4 mmol·L-1ABTS溶液和2.6 mmol·L-1過硫酸鉀溶液，將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液等體積混合，混合溶液置于黑暗中反應12～16 h，得到ABTS自由基溶液，以乙醇稀釋ABTS自由基溶液，在734 nm處吸光度為0.7±0.02，配制50 mL濃度為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1總生物堿溶液，分別加入2 mL ABTS溶液，室溫下反應6 min，在734 nm處測定吸光度，計算總生物堿對ABTS自由基清除率。配制0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1維生素C溶液作為陽性對照。清除率=(A對照-A樣品+A空白) /A對照(其中,A樣品為樣品與2 mL ABTS溶液混合后的吸光度，A對照為2 mL ABTS溶液與50 mL一次混合后吸光度，A空白為以乙醇代替ABTS溶液測得的吸光度)。

2 結果分析

2.1 單因素試驗

在其他因素不變的條件下，提取時間對蕨麻總生物堿提取量的影響如圖1(a)所示，可知在時間為60 min時總生物堿提取量最高；提取溫度對蕨麻總生物堿提取量的影響如圖1(b)所示，溫度為80 ℃時總生物堿提取量最高；乙醇體積分數對蕨麻總生物堿提取量的影響如圖1(c)所示，乙醇體積分數為85%時總生物堿提取量最高；料液比對蕨麻總生物堿提取量的影響如圖1(d)所示，可知在料液比為1∶30處總生物堿提取量最高。

圖1 單因素試驗結果Fig. 1 Single-factor test results

2.2 響應面法優化提取工藝結果

2.2.1 Box-Behnken試驗與結果 通過Box-Behnken軟件獲得試驗方案如表2所示共29組，每組做3個重復并測定其提取液中總生物堿含量，計算平均值填入表2中，利用Box-Behnken軟件對其進行分析。

表2 試驗與結果Tab. 2 Tests and results

2.2.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.5b軟件對2.2.1中試驗方案和試驗結果進行多元線性回歸擬合分析，得到蕨麻總生物堿含量與各因素間相互關系的回歸方程如下，方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Tab. 3 Results of ANOVA

總生物堿含量=1+0.17A-0.23B-0.04C-0.14D-0.072AB+0.052AC+0.045AD-0.17BC+0.24BD+0.14CD+0.046A2+0.39B2+0.19C2+0.1D2。

由表3可知蕨麻總生物堿提取模型的P<0.05，表明該回歸模型具有顯著性，因此用此模型對蕨麻總生物堿的提取工藝進行分析試驗是合理的。由F值大小可推斷出影響蕨麻總生物堿提取量的因素從大到小為B，A，D，C，也可以看出B2和C2對響應值的影響顯著(P<0.05)。

2.2.3 響應面分析 根據Design-Expert 8.0.5b軟件分析得出影響蕨麻總生物堿提取量的因素間交互作用的響應面圖，見圖2(彩圖見封三)。

由圖2(a)可知，當只有溫度與時間相互影響蕨麻總生物堿提取量時，溫度相比時間對蕨麻總生物堿提取影響更大；由圖2(b)可知，當只有提取時間與乙醇濃度交互影響時，兩者對于總生物堿提取量的影響近似相等；由圖2(c)可知，當只有提取時間與料液比相互作用時，時間相比料液比對蕨麻總生物堿提取影響更大。

圖2 提取時間、提取溫度、乙醇體積分數和料液比的交互影響Fig. 2 Interaction between extraction time and extraction temperature, ethanol concentration, feed-liquid ratio

由圖2(d)可知，當只有提取溫度與乙醇體積分數相互影響時，溫度相比乙醇體積分數對蕨麻總生物堿提取影響更大；由圖2(e)可知，當只有提取溫度與料液比交互影響時，兩因素對總生物堿提取量影響相差不大；由圖2(f)可知，當乙醇體積分數與料液比交互影響時，料液比相比乙醇體積分數對蕨麻總生物堿提取影響更大。

2.3 工藝驗證試驗結果(見表4)

表4 工藝驗證試驗結果Tab. 4 Process validation test results

2.4 蕨麻總生物堿抗氧化性試驗結果(見圖3)

圖3 總生物堿質量濃度對DDPH和ABTS自由基清除率Fig. 3 DDPH，ABTS radical scavenging rate of total alkaloid content

3 結論與討論

本研究利用響應面優化軟件優化了乙醇回流提取蕨麻總生物堿的工藝，單因素結果顯示隨著時間、溫度、濃度的增加提取量先增加再降低；隨著料液比的減少先增加再減少。但當因素間相互影響時，在選定區間內提取時間對提取量的影響接近于正相關；提取溫度、乙醇體積分數、料液比等因素對總生物堿提取量全都是隨著提取溫度、乙醇體積分數、料液比的增大先減小再增大。利用響應面法優化出的提取工藝測定了青海蕨麻3號地上部分總生物堿含量，并在根據實際情況修正后初步測得青海蕨麻3號總生物堿含量為2.324 mg·g-1，與理論預測值2.575 mg·g-1相差不大。蕨麻總生物堿對DPPH和ABTS均有抗氧化作用，對ABTS的抗氧化作用優于DPPH。

在植物次生代謝產物的提取過程中，提取方法、提取溶劑的種類、提取時間、提取次數、提取溫度、溶劑的濃度、液料比等都會對獲得提取物的量產生影響。本次試驗選取提取溫度、提取時間、溶劑濃度和料液比等對于蕨麻總生物堿提取影響較大的幾個因素進行了優化。在生物堿含量的測定中緩沖液的pH、萃取的次數及萃取劑的選擇等都會對總生物堿的含量測定產生影響，本次研究對單因素試驗考慮仍不全面，選取因素較少，有必要對影響總生物堿含量測定的因素進行更細致的研究。本研究對蕨麻總生物堿的抗氧化活性進行了初步探究，為后續蕨麻總生物堿的抗氧化類產品研究奠定基礎。