雞新城疫病毒等三重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

吳繼陽(yáng)，王 冰

(遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

近幾年來(lái)，隨著國(guó)家禽業(yè)規(guī)模集約化程度不斷提高，雞群養(yǎng)殖工作質(zhì)量得到明顯提高，但同時(shí)也出現(xiàn)了雞群混合感染和二次感染情況。雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒是這其中最為常見(jiàn)，也是危害最大的疾病，已經(jīng)得到了人們的高度重視。從癥狀上看，3種疾病臨床特征較為相似，難以區(qū)分，必須要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的具體驗(yàn)證后進(jìn)行確診。本文通過(guò)設(shè)計(jì)雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒的特異性擴(kuò)增引物，建立形成三重PCR檢測(cè)方法體系，不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法中存在不足，同時(shí)也進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率。因此，急需要建立形成一個(gè)高效快速的檢測(cè)方法，降低病毒危害。

為了判斷三重PCR檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用效果，分別從各類(lèi)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)置了雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒。在此基礎(chǔ)上，完成對(duì)基因的設(shè)計(jì)和合成，并且形成特異性引物序列表，其中3種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為687bp、453bp、239bp。在此基礎(chǔ)上，對(duì)三重PCR檢測(cè)方法反應(yīng)條件性全面的優(yōu)化設(shè)計(jì)，完成特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)。

1 測(cè)試結(jié)果分析

采用三重PCR檢測(cè)方法條件，對(duì)雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒的單一模板和混合模板展開(kāi)了進(jìn)一步的檢測(cè)。從實(shí)際結(jié)果來(lái)看，分別檢測(cè)出了最初的3種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，分別為687bp、453bp、239bp。而且對(duì)照病原體均呈現(xiàn)陰性，由此可知，該種檢測(cè)方式特異性良好。從敏感性實(shí)驗(yàn)來(lái)看，雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒的原始核酸濃度分別為25.3ng/μL、63.6ng/μL、20.1ng/μL，而三重PCR檢測(cè)方法下測(cè)出的數(shù)據(jù)分別為2.5pg、6.4pg、2.0pg，由此可知，該種方法的敏感性較高。圖1、圖2和圖3分別為三重PCR檢測(cè)方法特異性、敏感性以及重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒三重PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性進(jìn)行試驗(yàn)，從混合模板的結(jié)果來(lái)看，在反復(fù)5次的試驗(yàn)過(guò)程中，均可以擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶，且條帶均勻一致，可以確定三重PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性好。從特異性、敏感性、重復(fù)性這三方面的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，三重PCR檢測(cè)方法應(yīng)用在雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒具有較大的優(yōu)勢(shì)，不僅可以完成單一模板的檢測(cè)，同時(shí)還能夠完成混合模板的檢測(cè)，并其將混合的病毒有效分離。

圖 1 三重PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖 2 三重PCR檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖 3 三重PCR檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2 臨床檢測(cè)效果

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒三重PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用效果進(jìn)行分析。以廣西地區(qū)多個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)中取出50份樣品，在送樣后得到的檢測(cè)結(jié)果如下。有1份雞新城疫病毒陽(yáng)性、9份雞細(xì)小病毒陽(yáng)性和2份禽流感病毒陽(yáng)性樣品，其中包含2份雞細(xì)小病毒和禽流感病毒均呈陽(yáng)性的樣品，1份雞細(xì)小病毒和雞新城疫病毒均呈陽(yáng)性的樣品。由此可知，該養(yǎng)雞場(chǎng)中已經(jīng)出現(xiàn)混合感染的病例，其他養(yǎng)雞場(chǎng)要立即開(kāi)展相應(yīng)的防控處理。經(jīng)過(guò)前文的對(duì)比分析來(lái)看，在對(duì)陽(yáng)性的樣品進(jìn)行克隆和序列分析的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性樣品和實(shí)際的雞新城疫病毒、雞細(xì)小病毒和禽流感病毒的序列100%同源，由此可知，將三重PCR檢測(cè)方法應(yīng)用其中，可以準(zhǔn)確高效的完成檢測(cè)，為后續(xù)的免疫治療工作奠定良好的基礎(chǔ)。