雞新城疫病毒等三重PCR檢測方法的建立及應用

吳繼陽，王 冰

(遼寧省農業發展服務中心，遼寧 沈陽 110000)

近幾年來，隨著國家禽業規模集約化程度不斷提高，雞群養殖工作質量得到明顯提高，但同時也出現了雞群混合感染和二次感染情況。雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒是這其中最為常見，也是危害最大的疾病，已經得到了人們的高度重視。從癥狀上看，3種疾病臨床特征較為相似，難以區分，必須要通過實驗室的具體驗證后進行確診。本文通過設計雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒的特異性擴增引物，建立形成三重PCR檢測方法體系，不僅彌補了傳統PCR檢測方法中存在不足，同時也進一步提高了檢測效率。因此，急需要建立形成一個高效快速的檢測方法，降低病毒危害。

為了判斷三重PCR檢測方法的實際應用效果，分別從各類實驗室購置了雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒。在此基礎上，完成對基因的設計和合成，并且形成特異性引物序列表，其中3種病毒的擴增產物長度分別為687bp、453bp、239bp。在此基礎上，對三重PCR檢測方法反應條件性全面的優化設計，完成特異性、敏感性、重復性試驗。

1 測試結果分析

采用三重PCR檢測方法條件，對雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒的單一模板和混合模板展開了進一步的檢測。從實際結果來看，分別檢測出了最初的3種病毒的擴增產物長度，分別為687bp、453bp、239bp。而且對照病原體均呈現陰性，由此可知，該種檢測方式特異性良好。從敏感性實驗來看，雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒的原始核酸濃度分別為25.3ng/μL、63.6ng/μL、20.1ng/μL，而三重PCR檢測方法下測出的數據分別為2.5pg、6.4pg、2.0pg，由此可知，該種方法的敏感性較高。圖1、圖2和圖3分別為三重PCR檢測方法特異性、敏感性以及重復性的實驗結果。在此基礎上進一步對雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒三重PCR檢測方法的重復性進行試驗，從混合模板的結果來看，在反復5次的試驗過程中，均可以擴增出相應的特異性條帶，且條帶均勻一致，可以確定三重PCR檢測方法的重復性好。從特異性、敏感性、重復性這三方面的試驗結果可以看出，三重PCR檢測方法應用在雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒具有較大的優勢，不僅可以完成單一模板的檢測，同時還能夠完成混合模板的檢測，并其將混合的病毒有效分離。

圖 1 三重PCR檢測方法特異性試驗結果

圖 2 三重PCR檢測方法敏感性試驗結果

圖 3 三重PCR檢測方法重復性試驗結果

2 臨床檢測效果

在此基礎上，進一步對雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒三重PCR檢測的臨床應用效果進行分析。以廣西地區多個養雞場中取出50份樣品，在送樣后得到的檢測結果如下。有1份雞新城疫病毒陽性、9份雞細小病毒陽性和2份禽流感病毒陽性樣品，其中包含2份雞細小病毒和禽流感病毒均呈陽性的樣品，1份雞細小病毒和雞新城疫病毒均呈陽性的樣品。由此可知，該養雞場中已經出現混合感染的病例，其他養雞場要立即開展相應的防控處理。經過前文的對比分析來看，在對陽性的樣品進行克隆和序列分析的過程中發現，陽性樣品和實際的雞新城疫病毒、雞細小病毒和禽流感病毒的序列100%同源，由此可知，將三重PCR檢測方法應用其中，可以準確高效的完成檢測，為后續的免疫治療工作奠定良好的基礎。