麝香烏龍丸對S1P誘導血管內皮細胞通透性的調控作用

馬煒秀，王志文，袁強，張愛國，曹穎

類風濕性關節炎(RA)是一種以滑膜病變為主的自身免疫疾病，表現為滑膜組織增生及血管翳生成，繼而侵蝕破壞關節[1]。研究表明，RA患者滑膜液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)濃度遠超過生理濃度[2]。高濃度S1P與血管內皮細胞表面的受體結合，減弱了內皮細胞間的連接，增加了血管通透性，損害了血管屏障功能[3]。RA新生血管內皮細胞排列不整齊，血管通透性增加，炎性細胞浸潤增多，不僅加重滑膜炎性反應，同時侵蝕軟骨。由此可見，血管內皮高通透性與RA的持續炎性反應和軟骨損傷有著密不可分的關系，增強血管內皮細胞屏障功能，有利于減弱滑膜組織的炎性反應。本研究通過S1P誘導人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)，建立血管內皮高通透性模型，觀察麝香烏龍丸對HUVEC通透性及連接蛋白的影響，以及其保護血管屏障減輕RA滑膜炎性反應的可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞株：人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購于上海中喬新舟生物科技有限公司。(2)藥物與試劑：麝香烏龍丸(成分：人工麝香、全蝎、地龍、制川烏、黑豆)委托頸復康藥業集團有限公司生產，每粒(100±5)mg。用水提法進行藥物粗提物的提取：將高速粉碎后的麝香烏龍丸，按一定比例加入蒸餾水,37℃攪拌浸泡過夜， 37℃下超聲80 Hz提取30 min， 離心取上清液冷凍干燥得麝香烏龍丸提取物，無菌過濾后于-20℃保存備用。S1P試劑(英國 Abcam 公司)，RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)， 胎牛血清 (德國Cegrogen公司)，Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化液(美國Gibco公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學研究所)，FITC-BSA(大連美侖生物技術有限公司)，熒光二抗Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)，β-肌動蛋白(β-actin)抗體(北京博奧森生物技術有限公司)， Claudin-5兔多克隆抗體(英國Abcam公司)，ZO-1兔多克隆抗體(美國Gene Tex公司)，Occludin 兔多克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養： 2018年8月—2019年11月于華北理工大學中醫學院實驗室進行實驗。HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培養基培養，1～2 d換液1次，每2～3 d傳代1次，傳代培養至對數生長期備用。

1.2.2 實驗分組：實驗分為3組。(1)對照組：HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2培養24 h；(2)S1P誘導組：含10%FBS的RPMI-1640培養基培養HUVEC 24 h后，去掉培養基，PBS沖洗2次，用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培養基干預30 min；(3)藥物組：麝香烏龍丸160 μg/ml提取物、10%FBS的RPMI-1640培養基培養HUVEC 24 h，去掉原培養基，PBS沖洗2次， 用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培養基干預30 min。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 CCK8實驗檢測HUVEC增殖抑制率：將HUVEC接種于96孔培養板，當細胞長至80%左右時，用無血清培養基同步24 h。分別加入RPMI-1640培養基及濃度為80、160、320 μg/ml麝香烏龍丸提取物的RPMI-1640培養基，培養24 h，去除原培養基。每孔加入CCK-8 10 μl、RPMI-1640培養基90 μl，繼續培養2 h，將酶標儀設置于450 nm波長處，檢測OD值。細胞抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%，其中，對照組為含HUVEC的培養基+CCK8，實驗組為含HUVEC的培養基+CCK8+麝香烏龍丸提取物，空白組為不含HUVEC的培養基+CCK8，實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 Transwell小室測定HUVEC細胞相對通透性：Transwell小室的上室加入HUVEC懸液，每孔為1×105個/cm2，5%CO2、37℃孵育箱培養，待細胞融合成單層后，按上述實驗分組處理各組細胞。上室中加入濃度為0.25 g/L的FITC-BSA 100 μl，下室中加入RPMI-1640無血清培養基600 μl，繼續培養1 h。在每個Transwell下室取100 μl培養基置于新96孔板中，熒光酶標儀測定熒光強度。通過以下公式計算濾過率，濾過率(%)=(C下室×V下室/C上室×V上室)×100%。C為收集液體的FITC-BSA質量濃度，V為液體的體積。實驗重復3次，取平均值。

1.3.3 連接蛋白免疫熒光染色觀察： 將HUVEC接種于蓋玻片上，待細胞融合成單層，換成空白RPMI-1640培養基培養24 h，待HUVEC細胞同步化以后，分組處理HUVEC細胞。干預完成后，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，1%BSA封閉30 min，分別加入一抗ZO-1(1∶100)、occludin(1∶200)、claudin-5(1∶200)，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入熒光二抗(1 ∶100)，37℃避光孵育2 h，PBS洗3次，加入DAPI后室溫避光孵育10 min，PBS洗3次，滴入防淬滅溶液，于熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測連接蛋白：取生長狀態良好的HUVEC細胞，按上述實驗分組處理內皮細胞，用PBS洗滌后加入RIPA裂解液，混勻，冰上裂解30 min后，4℃離心收集上清液。BCA試劑盒測蛋白濃度，常規SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉2 h，一抗 ZO-1(1∶500)、occludin(1∶1 000)、claudin-5(1∶1 000)，4℃孵育過夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，化學發光法(ECL)顯色。以β-actin為內參，進行細胞間蛋白表達的差異比較，并以 Image J軟件對條帶灰度值進行分析。實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 各組HUVEC細胞增殖抑制率比較 麝香烏龍丸提取物80、160、320 μg/ml抑制率分別為(1.114±1.483)%、(8.694±0.129)%、(14.839±0.563)%。不同濃度藥物組與對照組比較，80 μg/ml時差異無統計學意義(t=1.301，P=0.263)，160、320 μg/ml時比較差異均有統計學意義(t=116.852、45.636，P均=0.000)，160 μg/ml與320 μg/ml比較差異亦有統計學意義(t=18.422，P=0.002)。因此，本實驗選取麝香烏龍丸160 μg/ml提取物作為后續實驗的干預濃度。

2.2 3組HUVEC細胞通透性比較 3組FITC-BSA濾過率分別為(10.832±0.837)%、(21.002±1.727)%、(16.671±0.452)%。與對照組比較，S1P誘導組細胞FITC-BSA濾過率升高(t=9.180，P=0.001)。與S1P誘導組比較，藥物組FITC-BSA濾過率降低(t=4.206，P=0.014)。

2.3 3組免疫熒光檢測細胞連接蛋白表達比較 熒光顯微鏡下觀察，對照組HUVEC細胞的ZO-1、claudin-5及occludin蛋白主要分布于細胞邊緣，排列良好，熒光強；S1P誘導組3種蛋白表達減少，甚至缺失；藥物組3種蛋白表達較S1P誘導組明顯增加，見圖1、2、3。

2.4 3組Western-blot檢測細胞連接蛋白表達比較 與對照組比較， S1P誘導組細胞ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表達明顯減少(t/P=7.393/0.002、15.437/0.000、15.808/0.000)，而藥物組較S1P誘導組3種蛋白表達上調，差異均有統計學意義(t/P=6.586/0.003、3.554/0.024、2.971/0.041)，見圖4、表1。

表1 3組HUVEC細胞連接蛋白表達比較

3 討 論

RA是一種全身炎性反應性自身免疫疾病。表現為滑膜細胞增生，伴隨血管新生及炎性反應浸潤。滑膜病變的初期病理特征為血管擴張，擴張的血管提供充足的氧氣及營養支持，并促進炎性反應浸潤，導致關節滑膜結構異常[4-6]。同時滑膜組織中增生的血管結構發生改變，內皮細胞排列不規則，增加血管通透性，炎細胞浸潤，加重滑膜炎性反應。RA的促炎狀態與內皮屏障功能有關，Atehortúa 等[7]提出，炎性反應主要影響中小型血管(微血管系統)，內皮屏障功能異常是RA發病機制的重要組成部分，在炎性反應中，血管活性物質和促炎介質會引起血管通透性增加和血管損傷。由此可見，血管屏障功能異常、通透性增加在RA發展過程中起到了重要作用。

內皮間的緊密連接和連接蛋白的黏附特性決定細胞連接的通透性。其中緊密連接為組織結構完整性起到重要作用。緊密連接是由膜相關蛋白和不同類型的跨膜蛋白組成的，如ZO-1、claudin-5及occludin蛋白，這些蛋白將細胞膜與細胞骨架相連接，能夠調節血管內皮屏障功能[8-9]。ZO-1在調控內皮細胞屏障功能和形成中發揮重要作用，是調控細胞連接形成的重要組成部分，并且介導肌動蛋白細胞骨架的重組以形成功能性內皮連接[10]。occludin和claudins做為緊密連接蛋白復合物，是跨膜蛋白的關鍵組成部分，參與了內皮屏障功能調控[11]。claudin-5是claudins家族的蛋白質成員，參與內皮緊密連接的必需膜蛋白，是內皮細胞功能障礙和緊密連接活性的指標[12]，其表達過少或者重新分布，與內皮細胞的高通透性有關。由此可見，細胞接連的穩定是確保血管內皮屏障功能正常的基礎。

有研究發現，RA患者滑膜炎性因子持續浸潤與S1P水平升高有著密不可分的關系[2]。S1P是一種廣泛存在于真核細胞中的鞘磷脂信號分子，主要來源于紅細胞及血管內皮細胞。S1P與5種G蛋白(S1P1～5受體)結合，激活多種細胞內信號通路，導致不同的生物學效應,包括調節細胞屏障、細胞遷移、炎性反應因子和黏附分子的表達、血管再生等，是滑膜微血管結構異常的重要原因所在。已有研究表明，高濃度的S1P通過激活S1PR2，進而激活RhoA/RhoA通路，引起F-actin蛋白表達紊亂，并且使ZO-1發生解體，從而導致細胞間連接破壞，內皮屏障功能障礙[3]。由此可以看出，RA滑膜液中高濃度S1P可能是導致滑膜微血管內皮細胞連接減弱和血管內皮通透性增高的原因之一。本研究也證實高濃度S1P能誘導HUVEC細胞的高通透性，與上述文獻的研究結果一致，并進一步證實高濃度S1P處理后的HUVEC細胞間連接蛋白明顯減少，說明HUVEC通透性的增高與ZO-1、claudin-5及occludin 3種蛋白表達的減少有關。

麝香烏龍丸用于治療RA有多年的臨床實踐，且臨床療效確切[13]。以往研究表明，麝香烏龍丸可降低RA患者體內IL-18、FKN/CX3CL1表達[14]。動物實驗表明，麝香烏龍丸可改善佐劑性關節炎(RA)大鼠滑膜炎性反應發生及血管翳產生，可能與減少RA大鼠滑膜HIF-1α、MMP-2的表達水平有關[15]。麝香烏龍丸能夠抑制滑膜組織增生，減少炎性細胞浸潤，減輕軟骨和骨的損壞，并且能通過上調VE-cadherin和ZO-1表達改善膠原誘導性關節炎(CIA)小鼠血管新生[16]。由此可見，麝香烏龍丸治療RA的作用可能與麝香烏龍丸對血管內皮屏障的保護有關。因此本研究以HUVEC細胞連接為切入點，模擬RA關節中血管內皮細胞高濃度S1P的生存環境，探討麝香烏龍丸對血管內皮屏障功能的保護作用。結果表明，經麝香烏龍丸預處理后，暴露于高濃度S1P下的HUVEC通透性明顯降低。說明麝香烏龍丸對于高濃度S1P誘導的HUVEC通透性增強具有很好的保護作用，而這一作用主要與上調HUVEC中ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表達有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馬煒秀：實施研究過程，統計學分析，論文撰寫；王志文：課題設計，論文審核；袁強、張愛國：課題設計，統計分析及文獻整理；曹穎：課題設計，論文修改及審核