一株尿液標本分離獲得Actinotignum schaalii的鑒定及生物學特性分析

李莎，杜晶輝△，商希鵬，劉旭，李瑞仕，蔣建春

Actinotignum schaalii（A.schaalii）是一種兼性厭氧的革蘭陽性桿菌，1997年首次報道并被歸為放線棒菌屬（Actinobaculum），2015 年重新分類并命名為Actinotignum schaalii［1］。隨著微生物實驗室培養條件的完善以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術的廣泛應用，A.schaalii檢出率有所增高，且發現其與泌尿系感染密切相關。學者認為A.schaalii為引起尿路感染的新型病原體，值得關注［2］。目前國內尚無關于A. schaalii的任何文獻報道。本文報告1 例分離自尿液標本中的A. schaalii，從形態特征、培養特性及鑒定方法等方面進行闡述，為臨床診療提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 患者 男，66 歲，漢族，主因急性腦梗死后語言不利、左側肢體活動不利，于2020年1月19日入院。住院期間出現尿頻、排尿困難等泌尿系感染癥狀。尿常規結果顯示：白細胞1+（70 個/μL）、尿膽原2+（66 μmol/L）、尿白細胞計數155.80 個/μL、尿白細胞（高倍視野）28.04 個/HPF、細菌計數2 020.70 個/μL。臨床給予經驗性用藥（口服呋喃妥因腸溶片）并連續3 d 留取尿標本，培養48 h 后進行細菌鑒定。

1.2 主要儀器及試劑 VITEK MS 質譜儀（法國梅里埃公司），CO2培養箱（日本松下公司），哥倫比亞血平板和麥康凱平板（中國百博公司），沙保羅平板（鄭州安圖公司）。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養 以無菌方法留取的尿液，按照臨床檢驗操作規程（第4 版）接種于哥倫比亞血、麥康凱和沙保羅平板，37 ℃、5%CO2環境下培養24～48 h，觀察細菌菌落特征并涂片進行革蘭染色，鏡下觀察細菌形態特點。

1.3.2 細菌鑒定 （1）MALDI-TOF MS 技術鑒定菌株。取1 μL 標本凃于靶板上，加入1 μL CHCA 基質液，待完全干燥后，VITEK MS質譜儀進行鑒定。重復以上操作檢測3次。（2）16S rRNA 測序技術鑒定菌株。將菌株分純培養48 h后送天津金域醫學檢驗實驗室，對該菌進行基因組DNA 提取、16S rRNA 擴增、PCR 產物回收及測序，并將測序結果與GenBank數據庫中的序列進行比對。

1.3.3 序列比對及系統發育分析 將所得的基因序列提交至GenBank數據庫，使用BLAST軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）將所測分離菌的16S rRNA 基因序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，找到相似度高的幾組基因序列并下載，使用MEGA5.2軟件構建系統發育樹。

2 結果

2.1 分離菌培養及形態特點 在37 ℃、5%CO2環境下培養24 h的哥倫比亞血平板上可見細沙樣微小菌落；沙保羅和麥康凱平板上未見菌落生長。培養48 h后哥倫比亞血平板上可見白色、干燥、無溶血環小菌落，見圖1。取單個菌落涂片并進行革蘭染色，顯微鏡下為革蘭陽性短桿菌，形態不特異，似棒桿菌，見圖2。

Fig.1 Bacterial colony of the isolated strain圖1 分離菌的菌落形態

Fig.2 Morphology of Gram strain of the isolated bacteria(×1 000)圖2 分離菌革蘭染色的鏡下形態（×1 000）

2.2 分離菌鑒定

2.2.1 MALDI-TOF MS 鑒定結果 VITEK MS 質譜儀重復檢測3次，2次結果顯示為A.schaalii，質譜峰清晰可見，特征峰鮮明，可信度為99.9%，見圖3；1次檢測失敗，顯示波峰數目不足。

2.2.2 16S rRNA 基因測序鑒定結果 測序結果顯示分離菌與已知的A.schaalii16S rRNA 基因序列相似度為98.84%，GenBank 登錄號為NR116869.1，鑒定為A.schaalii，屬于放線棒菌屬，為兼性厭氧、革蘭陽性桿菌。

2.3 構建系統發育樹 MEGA5.2 軟件構建的系統發育樹顯示，該分離菌的系統發育位置與2 株A.schaalii在同一分支上，屬于同一種，所以該分離菌為A.schaalii（可信度為100%），見圖4。

3 討論

Fig.3 The mass spectrogram of the isolated strain圖3 分離菌的質譜圖

Fig.4 Phylogenetic tree of the isolated strain圖4 分離菌的系統發育樹

3.1A.schaalii的生物學特點A.schaalii屬于放線棒菌屬，為兼性厭氧菌，營養要求高，需在37 ℃、5%CO2哥倫比亞血平板上培養48 h 才能看到白色、細小、無溶血環的菌落，涂片經革蘭染色后可見革蘭陽性短桿菌，未見明顯菌絲，與常見放線菌形態不同。A.schaalii是人體泌尿系統、皮膚的正常菌群，常規培養生長緩慢甚至不生長，易被生長迅速的需氧菌覆蓋而忽視，這也是A.schaalii難以被發現的原因，尤其在尿液標本中。本實驗菌株來自一位長期臥床的老年腦梗死患者，入院治療1 個月間長期臥床，存在泌尿系感染風險。當患者表現出排尿頻繁、尿潴留時，尿常規檢查顯示白細胞和細菌數量增多，支持尿路感染。連續3 d采集尿液進行培養并檢測，第1 次檢出魏氏檸檬酸桿菌，第2、3 次均檢出純的A. schaalii。連續2 d 留取的尿標本均培養出純的A.schaalii，故可以排除污染的可能，提示A.schaalii為致病菌。第1 次尿檢結果只檢出魏氏檸檬酸桿菌，可能由于A.schaalii培養24 h 菌落生長不明顯，且被魏氏檸檬酸桿菌菌落覆蓋而被忽視。

3.2 MALDI-TOF MS 和16S rRNA 基因測序技術可用于A.schaalii的鑒定 該實驗菌株經VITEK MS質譜儀鑒定為A.schaalii，故選用16S rRNA基因測序技術進行確認，測序結果與GenBank 數據庫中的序列進行比對，顯示該菌與已知的A. schaalii16S rRNA基因序列相似度為98.84%，登錄號為NR116869.1，鑒定為A.schaalii，提示MALDI-TOF MS和16S rRNA基因測序可用于A. schaalii的鑒定。Prigent 等［3］回顧 分 析 2004 年 7 月 —2015 年 2 月 間 檢 測 出A. schaalii的情況，并評估 MALDI-TOF MS 在檢出A. schaalii中發揮的作用，結果顯示自 2011 年 11 月質譜技術應用于實驗室以來，A.schaalii檢出數量明顯增加，且與測序鑒定結果一致。相較于16S rRNA基因測序技術，MALDI-TOF MS 能夠準確、快速、低成本地鑒定A.schaalii，得到臨床實驗室廣泛應用。而通過生化反應鑒定細菌的方法，如API系統、Vitek鑒定系統無法鑒定A.schaalii，因為這些系統中沒有相關數據。直至2015 年Vitek ANC 卡數據更新后，才使得A.schaalii有可能通過生化反應得到鑒定，但是該數據庫尚不完善，鑒定結果會出現差異，本實驗室用Vitek ANC 卡進行鑒定，鑒定結果為齲齒放線菌。因此，MALDI-TOF MS 技術仍是該菌常規鑒定的首選技術。

3.3A. schaalii為新型尿路感染病原菌 隨著MALDI-TOF MS 技術的廣泛應用，A.schaalii檢出率日益提高，且有研究發現該菌與泌尿系感染密切相關，認為該菌為新型的泌尿系感染致病菌。Lotte等［2］匯總分析了與A. schaalii感染有關的 172 例患者，其中121例與尿路感染有關，且大多數平均年齡大于60 歲；兒童也有較高的感染A.schaalii的風險，迄今為止共報道了7 例（8 個月至16 歲的兒童）。Bank 等［4］的一項丹麥全國數據分析得到相似結果：A. schaalii感染風險最高的年齡組為≥55 歲組［10.9例/（百萬·年）］，以男性患者為主，且多有泌尿系感染的危險因素。此外，Lotte 等［5］還對 50 例檢測出A.schaalii的患者進行了為期3 年的前瞻性研究，發現有27 例的感染與A.schaalii有關，且其中14 例為泌尿系感染。關于A.schaalii的研究我國尚無相關文獻報道，本文為我國首次報告。

3.4A.schaalii感染的臨床治療方案 目前尚無關于A.schaalii感染的治療指南。Lotte等［2］指出，雖然氟喹諾酮類和復方新諾明類藥物廣泛用于治療泌尿系感染，但不推薦用于治療A.schaalii引起的泌尿系感染，因為A.schaalii對復方新諾明和二代喹諾酮類耐藥率高；但大多數菌株仍然對新型氟喹諾酮類藥物（左氧氟沙星、莫西沙星）敏感，對β-內酰胺類、四環素類、萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、利福平、呋喃妥因、慶大霉素等藥物也敏感；最有效的、值得推廣的治療方法是β-內酰胺類抗生素連續使用2 周。雖然治療的最佳時間尚未確定，但根據感染部位的不同，治療應該持續2 周或更長時間。本例患者在接受經驗性抗生素治療（口服呋喃妥因腸溶片3 d）后，泌尿系感染癥狀好轉，提示治療有效。如何快速、有效治療A.schaalii引起的泌尿系感染，尚需搜集更多臨床數據進行相關藥敏試驗。

綜上所述，A.schaalii為兼性厭氧的革蘭陽性放線棒菌，生長極其緩慢，易引起老年人泌尿系感染，為新型尿路感染致病菌。MALDI-TOF MS技術能夠準確、快速地鑒定該菌。當尿標本直接鏡檢可見革蘭陽性短桿菌，但培養陰性，且無明顯誘因的尿路感染復發時，臨床醫生應當考慮A. schaalii感染的可能，厭氧環境下或加5%CO2培養48 h 后鑒定。對于A.schaalii引起的尿路感染，尚無臨床治療指南，目前最有效的、值得推廣的治療方法是β 內酰胺類抗生素連續使用2周。