新鮮蒜黃香氣活性成分分析鑒定

甄大衛,杜文斌,王羽桐,譚 佳,謝建春,*

(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048;2.Department of Chemistry and Biology,Stevens Institute of Technology,NJ 07030)

蒜黃為大蒜幼苗,百合科蔥屬,是將大蒜鱗莖置于黑暗條件下軟化栽培得到[1-2]。蒜黃蒜香濃郁、味道鮮美、營養豐富、是餐桌上常吃的一道菜,受到人們的廣泛歡迎[3]。蒜黃中大蒜素具有殺菌、降血脂、抗氧化、提高免疫力等功效[4-7]。但人們對蒜黃的揮發性風味物質構成并不清楚。食品揮發性風味分析一般先采用某種前處理技術對風味組分萃取富集,再用氣相色譜-質譜聯用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)和氣相色譜-嗅聞(Gas Chromatography-Olfactometry,GC-O)等手段進行分析。常用的風味物質萃取富集方法為同時蒸餾萃取(Simultaneous Distillation Extraction,SDE)、固相微萃取(Solid Phase Micro Extraction,SPME)、溶劑輔助蒸發(Solvent Assisted Flavor Evaporation,SAFE)三種[8-9]。其中,SAFE基于高真空蒸餾的原理進行萃取,對風味物質的萃取率高[10],且操作溫度接近室溫,得到的風味提取物接近真實樣品,非常適于新鮮物料的風味物質提取。如楊夢云等[11]曾采用SAFE提取野韭菜花中的揮發性風味物質。在食品眾多揮發性成分中僅少數有氣味(即氣味活性化合物)對食品風味有貢獻。GC-MS屬于對物質的結構進行分析,給出的僅為食品揮發性成分的結構性信息,而GC-O結合了氣相色譜分離的高效性及人鼻的靈敏性,可給出化合物是否具有氣味(即氣味活性)及對總體香氣貢獻大小的信息。GC-O分析常用的檢測方法包括時間-強度法、頻率法、芳香提取物稀釋分析法(Aroma Extract Dilution Analysis,AEDA)。AEDA法操作過程為:將風味提取物逐級稀釋并GC-O分析,直到在嗅聞口評價員嗅聞不到任何氣味時停止,化合物被檢測到有氣味時的最高稀釋倍數定義為稀釋(Flavor Dilution,FD)因子。FD值越大表示該物質對整體食品香氣貢獻越大[8]。

近年來,本課題組采用SAFE處理樣品結合GC-MS和AEDA/GC-O分析,獲得了肉類[10,12]、醋[13]、油條[14]等多種食品的香氣活性物質構成信息。本實驗將采用該法分析鑒定新鮮蒜黃的香氣活性成分,研究結果可為蒜黃的貯藏加工及開發利用提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮蒜黃 4月市購;二氯甲烷、無水硫酸鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;C5-C25正構烷烴 色譜純,北京化學試劑有限公司;2-甲基-3-庚酮(≥95%) 北京百靈威科技有限公司。

溶劑輔助風味蒸發裝置 定制加工,如圖1;復合分子渦輪泵 英國Edwards公司;N-EVAP-12 干浴氮吹儀 美國 Organomation Associates 公司;刀式研磨儀 丹麥FOSS公司;7890A-5975C 型氣相色譜-質譜聯用儀、7890A 氣相色譜 美國 Agilent 公司;氣味測量儀 美國 DATU Inc 公司;Vigreux柱(50 cm×1 cm I.D.) 北京新維爾玻璃儀器有限公司。

圖1 溶劑輔助風味蒸發裝置示意圖Fig.1 Solvent-assisted flavor evaporation(SAFE)apparatus注:1:滴液漏斗;2:蒸餾瓶;3:恒溫水槽;4:蒸餾頭;5:冷阱;6:樣品收集瓶;7:冷阱。

1.2 實驗方法

1.2.1 SAFE提取 新鮮蒜黃切段成0.5 cm左右,稱取150 g,加入150 mL 二氯甲烷和50 mL蒸餾水勻漿,取二氯甲烷層的浸提液。再稱取150 g蒜黃,重復上操作。將兩次得到的浸提液合并,作為一份樣品,進行如下溶劑輔助風味蒸發處理。重復做三份樣品。

溶劑輔助風味蒸發時,超級恒溫水槽和蒸餾頭夾層循環水的溫度均設為35 ℃,液氮冷卻,系統壓力10-5Pa左右,處理時間2 h。收集餾出液,無水硫酸鈉干燥,先Vigreux柱濃縮、再氮吹濃縮,得0.3 mL濃縮液。

1.2.2 GC-MS 分析 濃縮液中加內標2-甲基-3-庚酮(10 μg/μL,溶劑二氯甲烷)進行分析。DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),起始柱溫40 ℃,以3 ℃/min升至230 ℃,230 ℃后運行2 min;進樣口溫度250 ℃;進樣1.0 μL;分流比20∶1;載氣為He(純度99.999%),流速1.0 mL/min。

電子轟擊離子源,能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;全掃描模式,質量掃描范圍50～450 amu;輔助加熱線溫度230 ℃;溶劑延遲1 min。

在相同氣-質條件下進樣C5～C25正構烷烴,按下式計算保留指數(retention indices,RI)。

式中:tn和t(n+1)分別為碳數為n、n+1的正構烷烴保留時間;ti為保留時間在tn和t(n+1)之間的化合物保留時間。

1.2.3 GC-O分析 由Agilent 7890A GC裝置及氣味測量裝置組成,毛細管柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm);起始柱溫40 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃;載氣為N2(純度99.999%);流速1 mL/min;進樣口250 ℃,不分流模式,進樣1.0 μL。

濃縮液用二氯甲烷按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81等倍數逐級稀釋,并分別進行GC-O分析,直到嗅聞口檢測不到氣味時停止。每種香味化合物的最高稀釋倍數即為稀釋(FD)因子。

1.3 數據處理

結果為三份樣品分析結果的平均值。GC-MS分析采用檢索NIST 11譜庫、與文獻保留指數比對鑒定化合物,化合物含量按如下公式計算。GC-O分析基于GC-MS分析結果、嗅聞的保留指數、及嗅聞的氣味鑒定化合物。

式中:mi:化合物在蒜黃中的含量(ng/g蒜黃);Ai:化合物的峰面積;A0:內標的峰面積;C0:內標的濃度(μg/μL);V0:內標液的體積(μL);m:所用蒜黃質量(g)。

2 結果與分析

表1為采用GC-MS、AEDA/GC-O兩種方法分析新鮮蒜黃SAFE處理后的濃縮液所得結果。

表1 新鮮蒜黃采用SAFE結合GC-MS和AEDA/GC-O分析結果Table 1 Analysis results of fresh blanched garlic leaves by solvent assisted flavor evaporation(SAFE)combined with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)and aroma extract dilution analysis of gas chromatography-olfactometry(AEDA/GC-O)

續表

2.1 GC-MS分析

由表1可知,采用GC-MS分析鑒定出39種揮發性成分,包括含硫化合物30種,約占所檢測出化合物總量的90%(由表1中此類化合物合計(ng/g)除以總計(ng/g)計算得到,下同),而不含硫的化合物9種,占10%。檢測到的含硫化合物中,硫醇3種(占4%)、硫醚15種(占72%)、噻吩7種(占7%)、其它含硫化合物6種(占7%),即以硫醚類占絕對量。不含硫化合物檢測到丙烯、丙醛、2-丙烯-1-醇等9種化合物(占10%),其中丙烯、丙醛推測經氧化或還原反應可轉化成2-丙烯-1-醇。對二甲苯、鄰二甲苯很可能來源于塑料袋的污染,因在食品包裝中常檢測到這兩個化合物[15]。

本實驗GC-MS檢測到的二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、甲基烯丙基硫醚、二甲基二硫醚、3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯等在新鮮大蒜中也曾檢測到,且在多數天然蒜揮發性成分報道中,也是二烯丙基二硫醚(大蒜辣素)的含量最高(占19%)[9,16-17]。其次,本實驗3-乙烯基-1,2-二硫環己-4-烯(占15%)和3-乙烯基-1,2-二硫環己-5-烯(占9%)含量也較高,這與張娜等[18]采用SPME/GC-MS分析新鮮蒜薹、潘璨等[19]和高京草等[20]采用SPME/GC-MS分析新鮮大蒜所得結果一致。但在其它新鮮大蒜的分析報道中,盡管二烯丙基二硫醚含量也較高,卻低于1,3-二硫雜環戊烷[21]、二烯丙基三硫醚[22]、二-2-丙烯基四硫醚[23]、1,3-二噻烷[24]的含量,而3-乙烯基-1,2-二硫環己-4-烯的含量很低或未檢測到[25]。

與其他研究者結果不同的原因,除與實驗材料(蒜的品種、部位等)有關外,還因樣品的分析處理條件不同造成。含硫化合物尤具有不穩定性,據報道[26-27],加熱或劇烈處理時大蒜成分都會發生變化。如宋丹丹等[28]使用超高壓處理大蒜,發現隨著處理壓力增大,大蒜的主要風味物質二烯丙基二硫醚含量明顯下降,陳海濤等[29]報道油炸后大蒜的硫醚類和含硫雜環類化合物的含量均大幅下降。故本實驗在水和二氯甲烷存在下對蒜黃勻漿處理,減少了勻漿過程產熱造成的影響及揮發性物質的損失,并使用溫和的溶劑輔助蒸發法進行提取,使蒜黃中的風味物質最大程度地保留,從而獲得新鮮蒜黃風味的全面信息。

2.2 AEDA/GC-O分析

陳海濤等[29]采用SAFE結合GC-O分析了新鮮大蒜的香氣活性成分。但目前檢索到的多數文獻仍僅采用GC-MS檢測大蒜揮發性成分[30],因此天然蒜類食材包括大蒜、蒜黃、蒜薹等的香味活性成分研究尚較缺乏。本實驗將蒜黃SAFE處理后,除了GC-MS分析,還采用AEDA/GC-O分析,研究結果對真正了解蒜黃香氣構成有指導性。由表1可知,新鮮蒜黃SAFE處理后的濃縮液進行GC-O分析,檢測到35個有氣味活性的保留指數區域,嗅聞到的氣味包括蒜辣味、洋蔥味、青草味、泥土味、烤肉味等。通過保留指數將GC-O嗅聞的氣味與GC-MS鑒定的化合物關聯,再結合氣味譜庫(參見http://www.flavornet.org/)、相關文獻,鑒定出35個氣味活性化合物,包括硫醇類(2種)、硫醚類(15種),噻吩類(7種)、含硫其它化合物(5種),不含硫化合物(6種)。

由于GC-MS檢測的為揮發性成分而GC-O檢測的為氣味活性化合物(即有氣味的物質),故二者分析結果有明顯差異。由表1,一些采用GC-MS分析從大蒜中常檢測到的甲基烯丙基硫醚、二甲基二硫醚、二烯丙基硫醚、甲基異丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-5-烯等硫醚類化合物,在GC-O分析時稀釋因子卻很小,從而表明這些化合物對蒜黃總體氣味貢獻很小。通過圖2將AEDA/GC-O分析的FD值分布與GC-MS分析總離子流色譜圖對比,可更明顯看出二者分析結果的差異。圖2中,3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯(化合物11,log3FD=10)、2-甲基二氫-3(2H)-噻吩酮(化合物10,log3FD=10)、1-氧-4,6-二氮雜環辛烷-5-硫酮(化合物9,log3FD=9)、2,3-二甲基噻吩(化合物5,log3FD=9)、二烯丙基二硫醚(化合物8,log3FD=7)、二甲基三硫醚(化合物6,log3FD=6)、2-乙烯基噻吩(化合物3,log3FD=6)的稀釋因子很高(log3FD≥6),表明這些化合物對總體香氣貢獻顯著。從嗅聞到的氣味特征看,二烯丙基二硫醚、二甲基三硫醚和2-乙烯基噻吩可能貢獻蒜的辛辣味;3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯可能貢獻青草香;1-氧-4,6-二氮雜環辛烷-5-硫酮可能貢獻煙熏、青草、甜香。由此推測,可能因3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯的青草香和1-氧-4,6-二氮雜環辛烷-5-硫酮的煙熏、青草、甜香緩和了蒜黃的辛辣味,使蒜黃不像大蒜那般辣。相比之下,同樣采用SAFE結合GC-O分析,陳海濤等[29]得出新鮮大蒜中僅二烯丙基硫醚、二甲基三硫醚、二烯丙基二硫醚等蒜辣味物質對蒜的風味有重要貢獻。以上新鮮蒜黃與大蒜在氣味活性化合物上的差異,恰恰解釋了大蒜比蒜黃辣味濃烈的原因。

圖2 AEDA/GC-O分析的FD值分布圖與氣-質聯機分析總離子流色譜圖比較Fig.2 Comparison of distribution of FD values in AEDA/GC-O analysis with the total ion current chromatogram in GC-MS anaylsis注:僅對AEDA/GC-O檢測到的高稀釋因子化合物(log3FD≥2)標注了編號；1:烯丙基硫醇;2:3,4-二甲基噻吩;3:2-乙烯基噻吩;4:2,4-二甲基噻吩;5:2,3-二甲基噻吩;6:二甲基三硫醚;7:3-甲硫基丙醛;8:二烯丙基二硫醚;9:1-氧-4,6-二氮雜環辛烷-5-硫酮;10:2-甲基二氫-3(2H)-噻吩酮;11:3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯;12:3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-5-烯;13:呋喃-2-二硫代甲酸甲酯;14:己酸;15:2-噻吩甲酸甲酯。

3 結論

采用SAFE結合GC-MS分析新鮮蒜黃,檢測出39個揮發性成分,主要為硫醚類,含量最高的為二烯丙基二硫醚(大蒜辣素),其次為3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯和3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-5-烯。AEDA/GC-O分析鑒定出35種香氣活性物質,稀釋因子高的為3-乙烯基-1,2-二硫雜環己-4-烯、2-甲基二氫-3(2H)-噻吩酮、1-氧-4,6-二氮雜環辛烷-5-硫酮、2,3-二甲基噻吩、二烯丙基二硫醚、二甲基三硫醚、2-乙烯基噻吩。盡管新鮮蒜黃與天然大蒜GC-MS檢測到的揮發性成分類似,但二者強勢香氣活性物質組成不同,這也是大蒜與蒜黃風味有差別的原因。研究結果可為蒜黃的貯藏加工及開發利用提供技術指導。