廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌3種毒力基因檢測及tlh基因的蛋白表達

劉 杰，賀曉晨，黎姍梅，黃艷華，張振豪，黃德生，楊廷雅，吳偉鋒，梁靜真，黃 鈞

(1.廣西財經學院，廣西 南寧530003；2.廣西大學動物科學技術學院/廣西水生動物病害診斷實驗室，廣西 南寧，530005；3.廣西水產技術推廣站，廣西 南寧，530022；4.欽州市水產技術推廣站，廣西 欽州，535000；5.防城港市港口區漁業技術推廣站，廣西 防城港，538002；6.合浦縣水產技術推廣站，廣西 北海，536100)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，其養殖業已成為廣西水產養殖的主導產業，但近年來病害頻發，嚴重制約凡納濱對蝦產業的可持續健康發展。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種嗜鹽、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于蝦、蟹、貝等海產動物體內以及河口、海洋等環境中，能引發對蝦發生紅體病、爛鰓病、白濁病、急性肝胰腺壞死病等病害以及生長緩慢等癥狀，嚴重危害對蝦養殖業的健康發展[1-3]。副溶血弧菌也是世界范圍內重要的食源性致病菌，其危害性僅次于霍亂弧菌和沙門氏菌[4]。對副溶血弧菌進行毒力因子檢測，針對毒力因子進行克隆和原核表達，在副溶血弧菌流行病學調查和凡納濱對蝦病害防治等方面均有重要意義。溶血毒素是副溶血弧菌重要的毒力因子之一，包括不耐熱溶血毒素(tlh)、耐熱直接溶血毒素(tdh)、相對耐熱直接溶血毒素(trh)等，這3種毒素分別由tlh、tdh和trh基因編碼。已有研究表明，tlh在各種來源副溶血弧菌中檢出率高達82.4%～100.0%；tdh在腹瀉和食品中毒患者分離株的檢出率超過95.0%；而trh在各種來源副溶血弧菌檢出率一般不超過6.0%[5-8]。tlh本身無直接溶血活性，只有當卵磷脂存在時才具有溶血活性[9]。tlh基因在副溶血弧菌中存在廣泛性和種屬特異性，李志峰[9]、趙永剛[10]均對副溶血弧菌tlh基因進行了蛋白表達。對蝦副溶血弧菌病是近年來廣西凡納濱對蝦養殖過程中的常見病之一，但至今鮮見有關廣西蝦源副溶血弧菌溶血毒素基因攜帶情況的研究報道。本試驗對67株廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌進行3種毒力基因tdh、trh和tlh檢測，同時對tlh基因進行了蛋白表達，旨在查明廣西凡納濱對蝦副溶血弧菌3種溶血素基因攜帶情況，為對蝦副溶血弧菌病的有效防控及弧菌疫苗的研發、抗tlh單克隆抗體的制備提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

受試菌株為2013年至2016年間分離自廣西欽州、防城港和北海3市養殖凡納濱對蝦的67株副溶血弧菌。

細菌基因組DNA提取試劑盒以及PCR引物購自賽默飛世爾科技公司；pET-28a質粒購于云舟生物科技(廣州)有限公司；PVDF膜、Tween-20、Anti-6×His tag(小鼠單克隆抗體)、羊抗鼠IgG(H+L)等均購于索萊寶科技有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH 5α、pMD18-T載體、T4 DNA Ligase、Hind III、EcoRⅠ等均購于寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1tdh、trh和tlh3種毒力基因檢測 參考趙永剛[10]的方法，PCR擴增反應體系共計25 μL，包括10 mM dNTPs 1 μL，10 μM的上下游引物各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA酶(5.0 U/μL)0.5 μL，25 mM MgC123 μL，DNA模板2.0 μL，余下體積由ddH2O補足。反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃終延伸10 min。PCR引物的序列、退火溫度以及預計片段長度見表1。

表1 PCR反應引物序列、預計片段長度及退火溫度

將PCR產物進行純化回收，將回收產物與pMD18-T載體進行連接，然后轉化入大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，在含有X-Gal、Amp(氨芐青霉素)、IPTG的LB固體培養基中均勻涂布150 μL。37 ℃培養24 h后挑選白色菌落接種于LB液體培養基(含有Amp)中，180 rpm振蕩培養12～16 h。以菌液作為模板進行PCR擴增，將陽性菌液送華大基因進行測序。

1.2.2tlh基因的生物信息學分析 用MEGA軟件的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.3tlh基因原核表達載體構建 在tlh基因上下游引物分別加入限制性內切酶EcoRⅠ和Hind III酶切位點，引物序列如下，F: 5'-CGGAATTCATGATGAAAAAAACAATC-3'，R: 5'-CGAAGCTTTTAGAAACGGTACTCGGC-3'。PCR反應體系、反應條件和連接轉化方法同1.2.1，構建重組質粒pMD18-T-tlh并送華大基因測序。

將重組質粒pMD18-T-tlh和pET-28a載體用EcoRⅠ和HindIII分別進行雙酶切，將酶切后的tlh片段與pET-28a載體連接，連接體系為：10×buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 2 μL，tlh回收產物和pET-28a載體各5 μL，ddH2O 6 μL，將連接產物轉化入大腸桿菌 DH5α感受態細胞中，取150 μL菌液涂布于LB固體培養基中(含有卡那霉素、X-Gal、IPTG)。37 ℃培養16～24 h后，挑選白色菌落接種于LB液體培養基內(含卡那霉素)，37 ℃、180 r/min振蕩培養16 h左右，提取質粒DNA，進行鑒定。

1.2.4 原核表達載體的誘導表達 將重組質粒pET-28a-tlh轉化到大腸桿菌 BL21(DE3)感受態細胞中，挑單個菌落接種于總體積為5 mL的LB液體培養基中(含卡那霉素)，于37 ℃、180 rpm振蕩培養18～24 h。取過夜培養物10 mL轉接于100 mL上述LB液體培養基中。在菌液的OD600值為0.6時，用IPTG進行誘導，IPTG終濃度為0.8 mM。經過3～6 h的誘導后，取1 mL菌液離心去上清，加入100 μL高效RIPA細胞裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟，反復混勻后于冰上放置20 min，離心5 min，收集上清進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 原核表達產物SDS-PAGE和Western blotting鑒定 取15 μL上清液，向上清液中加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer 5 μL，煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳凝膠在轉膜儀中將蛋白轉至0.22 μm的PVDF膜上，轉膜條件為10 V、10 min。轉膜結束后，以TBST溶液洗滌2次，每次5 min；采用封閉液封閉約1 h；用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液按1 000∶1的比例稀釋Anti-6×His tag小鼠單克隆抗體，在4 ℃的搖床上搖約12 h；以TBST溶液洗滌5次；用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液按5 000∶1的比例稀釋羊抗鼠IgG(H+L)，在室溫搖床上搖約1 h；以TBST溶液洗滌5次；加顯色液在暗處顯色2～3 min，在凝膠成像系統下觀察顯色結果。

2 結果與分析

2.1 tdh、trh和tlh 3種毒力基因檢測

經PCR反復多次擴增，67株副溶血弧菌均未檢測到tdh和trh2種毒力基因，tlh毒力基因則全部檢出。PCR條帶大小與預測值接近(見圖1)。將PCR產物的測序結果進行Blast比對，結果表明，這些陽性條帶均為tlh基因序列。67株副溶血弧菌tlh基因序列之間的相似性為98.9%～100.0%。

2.2 tlh基因生物信息學分析

序列分析結果，HJ026、HJ083、HJ102、HJ123、HJ147、HJ172與副溶血弧菌標準株ATCC33846的tlh基因序列相似性為99.1%～99.5%。基于tlh基因序列構建遺傳進化樹(見圖2)，結果表明，這6株廣西副溶血弧菌與副溶血弧菌ATCC33846、Vp-18、1937聚為一支，親緣關系相對較近，與溶藻弧菌(V.alginolyticus)V05和哈維氏弧菌(V.harveyi)vh218的親緣關系相對較遠。

2.3 tlh基因的蛋白表達及鑒定

隨機選取菌株HJ083的基因組DNA為模板、使用含限制性內切酶位點的引物進行tlh基因擴增。將回收的目的片段與pMD18-T載體連接并進行轉化后送測序。結果表明成功構建重組質粒pMD18-T-tlh。將pMD18-T-tlh和原核表達載體pET-28a分別進行雙酶切，然后將兩者連接并進行轉化后送測序。重組質粒pET-28a-tlh雙酶切后分別在約5 300 bp和1 200 bp處出現明顯條帶，其中5 300 bp左右與 pET-28a條帶大小相符，1 200 bp左右與tlh基因大小相符(見圖3)。結合測序結果證明重組質粒pET-28a-tlh構建成功。

將pET-28a-tlh轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經過IPTG誘導表達后，進行SDS-PAGE電泳和Western blotting鑒定。電泳結果，含pET-28a-tlh、經IPTG誘導的大腸桿菌其表達產物在53 kDa左右處出現了一條蛋白條帶，其分子量大小與預測值接近；含pET-28a-tlh而未經誘導的大腸桿菌表達產物則無此特異性條帶，初步判斷目的蛋白tlh-HJ083表達成功(見圖4)。Western blotting鑒定結果，抗6×His的單克隆抗體能與tlh-HJ083重組蛋白發生特異性反應，進一步證明tlh-HJ083蛋白表達成功(見圖5)。

3 討論

弧菌能通過溶血毒素裂解紅細胞膜，tdh和trh均具有溶血活性、細胞毒性和腸毒性；tlh本身無直接溶血活性，需要卵磷脂的存在才具有溶血活性[2]。根據胡夢華[5]、代敏等[6]、謝紅意等[7]、徐奮奮[8]、張海強[2]等學者對副溶血弧菌的毒力基因的研究結果，副溶血弧菌的tdh基因在人類臨床分離株中檢出率較高，而在水產品分離株上的檢出率要遠小于人類臨床分離株，trh基因在水產品分離株和人類臨床分離株的檢出率接近。本試驗對廣西欽州、北海和防城港3市67株凡納濱對蝦源副溶血弧菌進行tdh、trh及tlh3種溶血毒素基因的檢測，結果顯示，tdh和trh基因均未檢出，tlh基因檢出率為100.0%，與胡夢華[5]的研究結果一致，tdh和trh基因的檢測結果與徐奮奮等[8]對寧波小水產品副溶血弧菌的檢測結果也相同，但與謝紅意等[7]其他研究者的結果存在較大差異。這是否與副溶血弧菌的不同來源有關，尚須作進一步的研究。值得關注的是，已有研究表明，tdh-/trh-/tlh+基因型的副溶血弧菌對小鼠和人類均具有致病性[11]。因此，對于副溶血弧菌的致病性，不能僅根據菌株是否攜帶tdh或trh基因來判斷，還需對諸如尿素酶、黏附因子等毒力因子進行檢測綜合判斷[12]。

弧菌病是對蝦養殖中常見且危害較嚴重的一類疾病。在弧菌病防治方面，多年來養殖戶主要采用抗生素進行治療，但抗生素容易導致細菌產生耐藥性，也容易引起藥物殘留或環境污染等問題。因此，弧菌疫苗的研制日益受到人們的重視。在生產實踐中，如將對蝦幼體轉入到含有滅活弧菌的水體中，對蝦的免疫力可維持到蝦體收獲[13]。陳華等[14]克隆了鋸緣青蟹副溶血弧菌的tlh基因，并表達了其編碼蛋白，以純化的tlh蛋白免疫小白鼠得到血清效價達8 000。王榮智[15]成功表達了副溶血弧菌tlh蛋白，并用純化的tlh蛋白免疫Balb/c小鼠，獲得了血清效價為16 000的抗血清。本試驗采用表達載體pET-28a進行蛋白表達，表達產物中的重組蛋白具有6×His標簽，6×His標簽分子量比較小，在生理條件下不帶電荷，因此幾乎不會影響目的蛋白的結構和功能。后續可利用鎳離子和His標簽相結合的性質純化目的蛋白。本試驗還采用Western blotting法鑒定了tlh-HJ083重組蛋白，發現重組蛋白能與抗6×His標簽的單克隆抗體發生特異性反應，進一步證明了tlh-HJ083蛋白表達成功。本試驗成功表達了廣西蝦源副溶血弧菌tlh重組蛋白，為后續廣西蝦源副溶血弧菌疫苗的研制、抗tlh單克隆抗體的制備提供了參考，但要將試驗結果成功應用于生產實踐仍須開展大量的后續研究。