斑點叉尾鮰致病性類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥物敏感性

呂小燕，袁漢文,何愛美，楊文秀，張哲華，鄭楚文，李 騫，許巧情

(1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.應城市農業技術推廣中心，湖北 孝感 432400)

斑點叉尾鮰(IetalurusPunetaus)屬鯰形目，鮰科，亦稱溝鯰，其體形較長，無鱗，尾鰭分叉較深，背部淺灰色，腹部乳白色，體兩側有不規則淺黑色斑點[1]。斑點叉尾鮰原產于美國，上個世紀六十年代開始商業化成魚養殖，被世界公認為最適合加工的優質淡水養殖品種之一[2]，然而養殖中細菌性疾病的發病率不斷上升，造成斑點叉尾鮰大規模死亡，嚴重阻礙了斑點叉尾鮰產業的發展。斑點叉尾鮰病害常見有細菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等，而細菌性疾病中主要有腸道敗血癥、腐皮病、爛鰓病以及腸套疊病[3]。對斑點叉尾鮰細菌性病原進行分離鑒定，發現11個致死率高的菌株，其中4個菌株為叉尾鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)，4個菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)以及未能鑒定的另外3個菌株[4]。而對斑點叉尾鮰腸敗血癥病原分離發現兩株G-短桿菌，經鑒定后為致病性叉尾鮰愛德華氏菌。劉禮輝等[5]從斑點叉尾鮰爛鰓中分離出一株(0.3～0.5)μm×(5～10)μm革蘭氏陰性菌，經鑒定后為柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)。關于對斑點叉尾鮰類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)的尚未見報道，本研究通過16S rRNA基因序列分析以及藥敏試驗對斑點叉尾鮰類志賀鄰單胞菌進行分離鑒定，以期為斑點叉尾鮰細菌性疾病的研究提供基礎理論依據和生產實踐中的防治方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年5月斑點叉尾鮰病魚取樣于湖北荊州萬樂源有限公司基地，體長42～50 cm，體重2～3 kg。牛肉膏蛋白胨肉湯培養基(LB)、諾氟沙星、多粘菌素B、頭孢曲松、萬古霉素、復方新諾明、氧氟沙星、四環素、多西環素、環丙沙星、丁胺卡納等30種抗菌藥物藥敏紙片，購自杭州微生物有限公司；dNTP(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×EasyTaq Buffer(1.2 mL)，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離與培養 將斑點叉尾鮰進行體表消毒后解剖，從脾臟、肝臟、腸等處取樣，接種于富含營養的培養基平板上，37 ℃恒溫過夜培養12 h，挑選優勢菌落，經純化后轉接至斜面培養基進行培養，觀察平板上菌落形態，選擇顏色不同、形態各異、大小不同的菌落，挑選單菌落，然后培養12 h，進行PCR檢測，連接轉化，分子凝膠成像檢測后測序。

1.2.2 藥敏實驗 用Kirby-Bauer紙片擴散法檢測藥物敏感性，在無菌條件下將病原菌致密劃線接種到普通平板，將各種藥敏紙片緊貼于培養基上，37 ℃培養18～24 h，測定抑菌圈直徑[6]。抑菌圈直徑d>15 mm，為敏感(S)；抑菌圈直徑10 mm

1.2.3 16S rDNA 序列的擴增與測序 PCR反應體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL d-NTP(10 mmol/L)，上、下游引物(F/R，10 μmol/L)各1 μL，0.25 μL r-Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA模板，dd H2O補足至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃下預變性5 min，95 ℃下變性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，72 ℃下延伸10 min，共32個循環，最后在72 ℃下再延伸10 min。擴增產物經0.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后，送武漢擎科生物技術有限公司測序。

1.2.4 PCR引物設計與合成 如表1所示。

表1 PCR擴增引物

2 結果與分析

2.1 斑點叉尾鮰發病主要特征

斑點叉尾鮰發病前期出現食欲減退，攝食減少，在水面盤旋游動，約半小時后，患病魚浮出水面，對斑點叉尾鮰進行檢驗觀察，發現體表有大量紅點，鰭基部與吻部均有充血現象，體外表皮有黃色不明物質，肛門紅腫，腹部鼓起。解剖觀察發現，腹部有透明液體流出，肝臟顏色腫大，無光澤，腸道呈充血狀(封三圖1所示)。

2.2 16S rRNA基因序列測定與系統分析結果

PCR產物經武漢擎科生物公司測序后，用Blast軟件對分離出的細菌進行16S rRNA序列比對，16S rRNA基因序列測定與系統發育樹構建分析，結果表明，圖2所示該菌株YZ1010與Plesiomonasshigelloidesstrain聚成一個分支，序列相似度為100%，親緣關系最為相近，即判定該菌為類志賀鄰單胞菌。

通過PCR檢測，得到的片段長度約為1 500 bp，與目標的16S rRNA條帶基本一致，電泳結果如圖3所示。

2.3 類志賀鄰單胞菌對藥物的敏感性差異

由表2可知，通過采用30種不同藥敏片進行檢測，發現在一定藥劑濃度范圍內，藥劑的濃度越高抑菌圈的直徑越大。其中發現類志賀鄰單胞菌對呋喃唑酮、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢呋辛5種藥物高度敏感；對氧氟沙星、頭孢氨芐、哌拉西林等11種藥物中度敏感；對環丙沙星、復方新諾明、羧芐西林等14種藥物不敏感。

表2 不同藥敏片的抑菌效果差異性

2.4 回歸感染實驗

從-80 ℃將保存的分離菌株類志賀鄰單胞菌進行復蘇，于37 ℃培養4～6 h，將菌懸液濃度調節為1×101～1×106cfu/mL。取健康的斑點叉尾鮰，進行人工感染。實驗組和對照組各準備20尾，每尾注射劑量為0.2 mL，對照組注射0.2 mL的PBS溶液(無菌的緩沖液)，實驗組注射復蘇的菌液，依次按照梯度進行注射，并且每天觀察2～4次，詳細記錄斑點叉尾鮰生長情況。

人工感染實驗中，實驗組中注射類志賀鄰單胞菌菌懸液后，濃度在1×101～1×106cfu/mL，死亡率呈現逐漸上升趨勢，濃度越高，斑點叉尾鮰死亡率越高(見表3)。注射PBS的對照組無死亡現象，也無任何病癥。人工感染后，菌株感染的斑點叉尾鮰，出現反應遲緩，不攝食，鰭基部均有充血，肛門紅腫，感染的實驗魚體腔充滿腹水，肝腫大，腸充血。感染后出現的癥狀與自然發病個體的癥狀基本相同。

表3 人工感染實驗結果

3 討論

近年來，伴隨著魚類養殖業不斷發展，由于養殖密度增大、水質惡化、投喂方式不當等因素，各種細菌引起的疾病也逐漸爆發，其中在魚類增養殖中類志賀鄰單胞菌是引起水產動物發病死亡的常見致病菌。類志賀鄰單胞菌為需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，在分子水平上與鄰單胞菌(Plesiomonas)屬和變形桿菌(Proteus)屬更為接近，因此類志賀鄰單胞菌劃歸到腸桿菌科，鄰單胞菌屬[7]。研究發現類志賀鄰單胞菌感染草魚(Ctenopharyngodonidellus)后導致其肌肉糜爛、肝臟有出血點、脾臟腫大、肛門紅腫等[8]，感染金魚(CarassiusauratusLinnaeus)、大鯢(Andriasdavidianus)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、鱘魚(Sturgeons)后也都會出現膽囊和脾臟腫大、采食量減少、肝臟點狀出血等一系列病癥[9-12]。而在本試驗中患病斑點叉尾鮰也出現類似癥狀。在臨床表現上類志賀鄰單胞菌感染的患病魚與常見的赤皮病、腐皮病相似，增加了診斷難度[13]。在回歸感染中，健康斑點叉尾鮰隨著注射類志賀鄰單胞菌菌液濃度減少，死亡尾數降低，而人工感染后出現的癥狀也與自然發病個體的癥狀基本相同。而在草魚、金魚、大鯢、尼羅羅非魚和鱘鑒定出的類志賀鄰單胞菌雖有種屬存在差異，但也表現出類似病癥[8-12]。這可能是病原微生物感染時，打破了動物腸道菌群動態平衡，而不同品種魚免疫機制存在差異，類志賀單胞菌感染導致魚類腸道免疫系統發生變化，從而影響腸道系統免疫功能[14]。

通過以保守的16S rRNA基因序列為基準，找到序列差異鑒定種屬，不依賴于微生物的分離培養，從而快速且準確鑒定微生物[15]。本試驗中通過PCR檢測，得到的片段長度約為1 500 bp，與目標的16S rRNA條帶基本一致，并且在16S rRNA基因序列測定與系統分析結果進一步證實分離菌株為類志賀鄰單胞菌。這與在類志賀鄰單胞菌感染的黃顙魚擴增得到的片段約為1 461 bp結果相似[16]。

目前環境污染和細菌耐藥性是影響水產行業發展的重大問題。在患病黃顙魚中分離的菌株類志賀鄰單胞菌，藥敏試驗表明該菌對頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，對四環素中度敏感，對苯唑西林、氨芐西林等不敏感[16]。龍蘇等發現類志賀鄰單胞菌感染的黃顙魚還對另外先鋒VI、菌必治、舒普深等16種藥物高度敏感，對青霉素G和氨芐青霉素都不敏感[17]。可見對于同一品種所感染的同一種病原株有多種防治藥物，因此在選擇的時候要具有針對性。在患病黃沙鱉幼鱉中分離出的類志賀鄰單胞菌對菌必治、舒普深、氟哌酸、多粘菌素B和環丙沙星高度敏感，但對青霉素G、氨芐青霉素、苯唑青霉素等15種藥物不敏感[18]。在患病雜交鱘中分離的類志賀鄰單胞菌對氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、多環西素4種藥物敏感，對卡那霉素、阿莫西林、泰樂菌素、復方新諾明4種藥物耐藥[19]。可見對于同一病原株在不同的養殖對象上，類志賀鄰單胞菌對于藥物的敏感性有所不同，這可能與病原來源、養殖環境、感染途徑不同有關。因此對斑點叉尾鮰進行藥物治療時，應更具有針對性，從而做到科學合理用藥，有效防控疾病。在斑點叉尾鮰病害研究上，類志賀鄰單胞菌的致病機理、致病功能基因、免疫防控等仍是需要重點研究的課題。