circ-PTPN22在系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中的翻譯及意義

仲志婷 苗青青 蔣柱燕 張夢潔 唐雋

1安徽醫科大學附屬解放軍聯勤保障部隊第901 醫院皮膚科，合肥230031；2陸軍軍醫大學病理生理與高原病理學教研室，重慶400038

環狀RNA（circRNA）是一種非編碼RNA分子，沒有5′端帽和3′端poly（A）尾部，通過共價鍵形成環狀結構［1］。circRNA 可作為miRNA 的“海綿”來調節下游靶基因的表達［2］，調節親本基因轉錄［3］，與RNA 結合蛋白相互作用［4］，以及翻譯蛋白質［5］。我們前期研究［6］采用高通量RNA測序，分析了3例系統性紅斑狼瘡（SLE）患者與3例健康對照外周血單個核細胞（PBMC）中circRNA 的差異表達，通過生物信息學分析篩選出4 個候選circRNA，并經實時熒光定量PCR（qRT-PCR）證實circ蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型（PTPN22）在SLE患者PBMC中表達降低，且與SLE 疾病活動指數（SLEDAI）評分呈負相關。本研究探討circ-PTPN22的翻譯能力及其翻譯蛋白對Jurkat細胞活化和凋亡的作用。

對象與方法

一、研究對象

2019 年5 月10 日至9 月30 日分別于西南醫院中西醫結合風濕免疫科和體檢中心收集6 例SLE女性患者（SLEDAI評分10 ～14分）和9例健康女性對照全血樣本，年齡25 ～50 歲。本研究經解放軍第105 醫院（現更名為解放軍聯勤保障部隊第901醫院）倫理委員會批準（ 倫理編號105LL20150308），所有受試者均簽署知情同意書。

二、細胞來源及主要試劑

Jurkat 細胞系來源于美國ATCC 細胞庫。RiboTM熒光原位雜交試劑盒（廣州銳博生物技術有限公司），circ-PTPN22-cy3探針和18S-cy3對照探針均由廣州銳博生物技術有限公司設計合成。內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗（美國Bioss公司），山羊抗兔抗體、山羊抗小鼠抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），circ-PTPN22-FLAG 和circ-PTPN22-NC-FLAG 重組慢病毒由上海生博生物醫藥科技有限公司構建，circ-PTPN22-shRNAFLAG和circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG慢病毒由上海泰兒圖生物科技有限公司合成。Dynabeads?Human T-Activator CD3/CD28 用于活化和擴增人T細胞（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。藻紅蛋白標記的抗人白細胞介素（IL）-2 抗體、7-AAD Viability Staining Solution（美國Biolegend 公司），小鼠抗FLAG?M2 單抗（美國Sigma-Aldrich 公司），ELISA 試劑盒（英國abcam 公司），RIPA 裂解液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、Quick-Blocker 封閉液、2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司），ExpressPlus?PAGE Gels 4%～20%（南京金斯瑞生物科技有限公司），EasySep?人T細胞分離試劑盒、EasySep?人B 細胞分離試劑盒、EasySep?人NK 細胞分離試劑盒（加拿大STEMCELL Technologies 公司），eBioscience?Foxp3 轉錄因子染色液（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

三、方法

1.PBMC分離：全血與磷酸鹽緩沖液（PBS）及樣本密度分離液體積比為1∶1∶1，805×g離心20 min，取白膜層，加PBS 10 ml，201×g 離心5 min 后棄上清液，得到PBMC。加入二甲基亞砜和胎牛血清（體積比1∶9），-80 ℃過夜，第2天轉入液氮中保存。

2.熒光原位雜交法觀察circ-PTPN22在健康人PBMC中的表達定位：針對circ-PTPN22剪接位點設計一段帶有cy3 標記的探針circ-PTPN22-cy3，對照組探針為18S-cy3。從3 例健康人5 ml 全血樣本中分離PBMC。50 μl PBS 重懸PBMC，取2 張多聚賴氨酸處理過的載玻片，分別標記為circ-PTPN22-cy3組和18S-cy3組。各取10 μl細胞懸液到載玻片，靜置待干。然后依次用4%多聚甲醛室溫固定10 min，預冷通透液4 ℃5 min，200 μl預雜交液37 ℃30 min，避光下將circ-PTPN22-cy3 和18S-cy3 兩種探針各1.5 μl 分別加入100 μl 預熱的雜交液混勻，棄去載玻片上的預雜交液，將探針混合物滴到含有細胞的載玻片上，放入濕盒，37 ℃避光過夜。第2天，42 ℃避光條件下，分別用雜交洗液Ⅰ、雜交洗液Ⅱ、雜交洗液Ⅲ洗滌，然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10 min，最后熒光顯微鏡下拍照。

3. Jurkat 細胞培養與慢病毒轉染：用RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素）、在37 ℃5% CO2恒溫孵箱中培養Jurkat 細胞，第2 天換液。為驗證預測的circ-PTPN22 蛋白編碼功能，分別將circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NCFLAG、circ-PTPN22-FLAG + circ-PTPN22-shRNAFLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 重組慢病毒［病毒載體含綠色熒光蛋白（GFP）基因］轉入Jurkat細胞（circ-PTPN22-FLAG 組、circ-PTPN22-NCFLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-FLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 組），同時設置Jurkat 細胞對照組（僅正常培養）。采用12 孔板，每孔5 ×105個細胞，每組各3 個復孔，重組慢病毒感染復數（MOI）均為50。培養48 h后收集細胞，期間可根據細胞生長狀態添加完全培養基和傳代。

4.circ-PTPN22pro 抗體制備與鑒定：委托上海烈冰生物醫藥科技有限公司測定circ-PTPN22核酸序列。根據測序結果，委托杭州華安生物技術有限公司［動物試驗許可證號：SYXK（浙）2017-0009］針對circ-PTPN22 剪接位點處的特異性氨基酸序列GNSNYLPVSLQELARP 合成肽段并制備多克隆抗體，然后使用親和層析柱純化抗體。采用常規多克隆抗體制備方法，選用2 只體重2.5 kg 左右的健康新西蘭雄性白兔（編號為4137、4138），采用多點皮下注射各免疫3次，首次免疫后第14天進行2次免疫，第2 與第3 次免疫間隔7 d，第3 次免疫后第7 天，于兔耳中動脈采少量全血提取血清進行間接ELISA檢測。檢測合格后，進行加強免疫，7 d后可采集全血。采用轉染了circ-PTPN22 的Jurkat 細胞鑒定所制備的多克隆抗體，將轉染的Jurkat細胞裂解上清液經SDS-PAGE電泳后，用所制備兔抗血清作為一抗進行Western印跡法分析。

5. 間接ELISA 法檢測制備的兔抗circ-PTPN22pro 抗體效價：按ELISA 試劑盒說明書依次進行包被抗原（合成的目的肽段）、1×TBST緩沖液洗滌、TBST配制的1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，加入稀釋的待檢樣品（即制備的抗體）37 ℃反應1 h、洗滌2 次。設置陽性對照孔（陽性血清）與陰性對照孔（BSA）。然后加辣根過氧化物酶標記二抗羊抗兔抗體孵育，1×TBST 緩沖液洗3次。加底物顯色，2 mol/L硫酸終止反應后，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度。各實驗孔與BSA陰性對照孔A450比值＞2.1時，為抗體滴度判定終點。

6.磁珠分選人PBMC：根據EasySep?Human T Cell Isolation Kit，分別用250 μl EasySep?緩沖液重懸3 例健康對照和3 例SLE 患者各15 ml 全血提取的PBMC，并用細胞計數板計數，每管加入50 μl/ml Isolation Cocktail，混勻后室溫等待5 min，振蕩30 s后每管加入40 μl/ml RapidSpheres?，用EasySep?緩沖液補齊至2.5 ml，混勻后放入配套的磁鐵中，室溫靜置3 min，垂直將細胞懸液倒入另一新流式管中，將新管放入磁鐵中，靜置3 min，同樣的方法倒出，得到分選后的T 細胞。參照上述方法分選B、NK細胞。用相應的抗體檢測細胞純度。

7. Western 印跡法檢測細胞中circ-PTPN22pro蛋白表達：按照“3.Jurkat 細胞培養與慢病毒轉染”中方法轉染48 h 后，收集各組Jurkat 細胞，RIPA 裂解液提取總蛋白。加入2 × SDS 蛋白上樣緩沖液（1∶1），煮沸變性。每孔上樣量30 μg，160 V恒壓電泳35 min，25 V 25 mA 6 min 半干轉到聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉30 min，分別加一抗小鼠抗FLAG標簽抗體（1∶1 000）、兔抗人GAPDH抗體（1∶4 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜5 次，每次6 min；加二抗山羊抗兔、山羊抗鼠抗體（均為1∶4 000）室溫搖晃孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，然后用Bio-Rad 成像儀曝光拍照。使用Image Lab 6.0 軟件計算每組circ-PTPN22pro 條帶與GAPDH 條帶的調整灰度值之比。此外，采用上述方法檢測3例健康對照和3 例SLE 患者PBMC 及另3 例健康對照和3 例SLE 患者T、B、NK 細胞亞群中circ-PTPN22pro 表達，一抗為制備的兔抗人circ-PTPN22pro 抗體（1∶500），二抗為山羊抗兔抗體。

8. 流式細胞儀檢測circ-PTPN22 對細胞活化和凋亡的影響：按照“3.Jurkat 細胞培養與慢病毒轉染”中方法將circ -PTPN22、circ-PTPN22-NC、circ-PTPN22 - shRNA、circ - PTPN22 -shRNA-NC 慢病毒分別轉染Jurkat 細胞（circ-PTPN22 組、circ-PTPN22-NC 組、circ-PTPN22-shRNA 組、circ-PTPN22-shRNANC 組）24、48 和72 h 后，每孔加Dynabeads ?Human T-Activator CD3/CD28 4 μl，恒溫孵育6 h 后收集轉染的Jurkat 細胞。分別用200 μl PBS重懸，各組取1×106細胞，加入200 μl穿孔液室溫20 min，500 μl 通透緩沖液453 × g 離心8 min，洗滌2次。重懸后每管加入1 μl藻紅蛋白抗人IL-2抗體，室溫避光20 min后洗滌2次，用含2%胎牛血清的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測IL-2陽性細胞比例，以檢測細胞活化狀態。此外，收集各組轉染48、72、96 h后的Jurkat 細胞，檢測前10 min每管加7-AAD Viability Staining Solution 2 μl，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，即7-AAD陽性細胞比例。

9.統計學方法：應用SPSS25.0 軟件，采用兩因素重復測量方差分析分別分析過表達和干擾circ-PTPN22 不同時間對Jurkat 細胞活化及凋亡的影響。采用GraphPad Prism8 軟件，兩組計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、circ-PTPN22在健康人PBMC細胞中的定位

熒光原位雜交法顯示，circ-PTPN22 和陽性對照18S 均主要表達在健康人PBMC 細胞質內，見圖1。

二、circ-PTPN22的翻譯能力預測

測序結果顯示，circ-PTPN22基因全長1 429 bp，含9 個外顯子。為預測該基因是否具有翻譯蛋白的能力，通過circRNADb 網站（http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）進行比對，預測出circ-PTPN22 第718 ～838位堿基共121 bp的內部核糖體進入位點（IRES）序列（圖2A 綠色序列）。因為測得的circ-PTPN22全長為1 429 bp，所以排除1 399 ～1 507 bp的潛在IRES 序列。翻譯能力預測見圖2B，ORF 框從910 bp 跨剪接位點至50 bp 處，潛在翻譯的蛋白質序列共189 個氨基酸，將其命名為circ-PTPN22pro；GNSNYLPVSLQELARP 序列為該編碼蛋白不同于全長PTPN22 蛋白的特異氨基酸序列（圖2B）。

圖1 熒光原位雜交法檢測circ-PTPN22在健康人外周血單個核細胞中的定位 圖像融合后可見circ-PTPN22與18S均主要表達在細胞質中

圖2 circ-PTPN22蛋白編碼預測 2A：circ-PTPN22基因的預測編碼序列；綠色部分代表IRES序列，灰色部分代表ORF框，跨剪接位點翻譯，紅色標記ATG、TGA分別為翻譯的起始密碼子和終止密碼子；2B：circ-PTPN22pro的預測氨基酸序列，序列的紅色部分是不同于全長PTPN-22蛋白的獨特氨基酸序列

三、circ-PTPN22pro多克隆抗體制備及鑒定

ELISA 結果顯示，3 次免疫后，2 只兔血清效價均達到1∶256 000。Western 印跡法鑒定circ-PTPN22pro 多克隆抗體顯示，4 137 號兔血清的特異性較好，相對分子質量為20 000左右的目的條帶顯示清晰，但未檢測到全長型PTPN22pro（相對分子質量98 000）（圖3），提示circ-PTPN22pro 多克隆抗體制備成功，特異性針對circ-PTPN22pro。因此，在后續臨床相關實驗中使用4 137 號兔血清進行實驗。

四、circ-PTPN22編碼功能驗證

轉染重組慢病毒后48 h，circ-PTPN22-FLAG組、circ-PTPN22-NC-FLAG組、circ-PTPN22-shRNAFLAG 組、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG 組細胞均有綠色熒光表達（圖4A），說明重組慢病毒轉染成功。Western 印跡結果顯示，circ-PTPN22-FLAG 組circ-PTPN22pro 表達明顯高于circ-PTPN22-NCFLAG 組和細胞對照組，且相對分子質量約為20 000；circ-PTPN22-NC-FLAG 組及細胞對照組有少量表達，提示Jurkat 細胞內源性表達circ-PTPN22pro（圖4B）。與circ-PTPN22-FLAG組相比，circ-PTPN22-shRNA-FLAG 組circ-PTPN22pro 表 達明顯降低，見圖4C。

五、circ-PTPN22對細胞活化和凋亡的影響

轉染24、48、72 h后，流式細胞儀檢測顯示，circ-PTPN22 組IL-2 表達（22.20% ± 8.92%，31.10% ±5.88%，53.20% ± 10.25%）均低于circ-PTPN22-NC組（30.90% ± 11.00%，51.23% ± 10.70%，69.67% ±9.00%）；circ-PTPN22-shRNA組IL-2表達（35.57%±8.79%，78.10%± 10.08%，88.63%± 3.89%）均高于circ-PTPN22-shRNA-NC 組（26.73% ± 4.92%，41.03% ± 10.45%，41.33% ± 4.96%），見圖5A、5B。兩因素重復測量方差分析顯示，circ-PTPN22 組與circ-PTPN22-NC 組間差異有統計學意義（F =284.881，P=0.003）；circ-PTPN22-shRNA 組與circ-PTPN22-shRNA-NC 組間差異亦有統計學意義（F=293.818，P=0.003）。

圖5 流式細胞儀檢測circ-PTPN22 對Jurkat 細胞活化和凋亡的影響 轉染24、48 和72 h 后，circ-PTPN22 組IL-2 表達均明顯低于circ-PTPN22-NC組（5A），circ-PTPN22-shRNA組IL-2表達均明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC組（5B）；轉染48、72、96 h后，circ-PTPN22組細胞凋亡率均高于circ-PTPN22-NC組（5C），circ-PTPN22-shRNA組細胞凋亡率亦明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC組（5D）

轉染48、72、96 h后，流式細胞儀檢測顯示，circ-PTPN22 組細胞凋亡率（7.08% ± 1.33%，19.17% ±3.29%，30.03% ± 9.24%）高于circ-PTPN22-NC 組（5.01% ± 1.52% ，5.63% ± 0.81% ，14.22% ±3.96%），且circ-PTPN22-shRNA 組細胞凋亡率（24.63% ± 10.58%，59.17% ± 15.64%，84.87% ±2.91%）亦明顯高于circ-PTPN22-shRNA-NC 組（6.59% ± 3.37% ，5.33% ± 1.65% ，15.42% ±7.31%），見圖5C、5D。兩因素重復測量方差分析顯示，circ-PTPN22 組與circ-PTPN22-NC 組間差異有統計學意義（F = 81.287，P = 0.012）；circ-PTPN22-shRNA 組與circ-PTPN22-shRNA-NC 組間差異亦有統計學意義（F=111.813，P=0.009）。

六、circ-PTPN22pro 在 健 康 對 照 和SLE 患 者PBMC中的差異表達

Western 印跡結果顯示，SLE 組PBMC 中circ-PTPN22pro 表達低于健康對照組，幾乎不表達（圖6A）。進一步用磁珠分選后結果顯示，SLE 組T、B細胞中circ-PTPN22pro 表達（0.398±0.147、0.072±0.027）均顯著低于健康對照組（1.090 ± 0.365、0.512 ± 0.157；t 值分別為3.047、4.806；P 值分別為0.038、0.009），SLE組與健康對照組NK細胞中circ-PTPN22pro 表達差異無統計學意義（0.139 ± 0.147比0.088±0.032；t=0.582，P=0.592），見圖6B。

討 論

一些有IRES 序列及ORF 框的circRNA 具有編碼蛋白能力［7］。我們在circRNADb數據庫比對circ-PTPN22序列，發現circ-PTPN22有跨剪接位點翻譯的ORF 框，并在Jurkat 細胞中檢測出circ -PTPN22pro表達。通過熒光原位雜交法，我們檢測出circ-PTPN22 主要在細胞質中表達，提示circ-PTPN22 可能主要在細胞質中發揮作用。與circ-PTPN22-NC 組相比，過表達circ-PTPN22 可抑制Jurkat 細胞活化，促進Jurkat 細胞凋亡；而干擾了circ-PTPN22 的表達可促進細胞活化，同時促進細胞凋亡。推測細胞凋亡的原因可能是干擾circ-PTPN22 表達后，circ-PTPN22pro 蛋白表達降低，導致細胞過度活化誘導了細胞凋亡［8］。

圖6 系統性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血單個核細胞（PBMC）及其T、B、NK 細胞亞群中circ-PTPN22 蛋白表達 6A：PBMC 中circ-PTPN22pro表達 3例SLE患者均明顯低于3例健康對照；6B：T、B細胞中circ-PTPN22pro表達 SLE患者均明顯低于健康對照，但兩組NK細胞中circ-PTPN22pro表達無明顯差異

通過制備兔抗circ-PTPN22pro 特異性多克隆抗體，我們檢測了SLE患者和健康對照PBMC及其T、B、NK細胞亞群中circ-PTPN22pro的表達。結果顯示，SLE 患者組PBMC 中circ-PTPN22pro 表達明顯低于健康對照組，甚至不表達；SLE 患者組T、B細胞亞群中circ-PTPN22pro 表達亦顯著低于健康對照組，而兩組NK 細胞中circ-PTPN22pro 表達無明顯差異。提示circ-PTPN22 和circ-PTPN22pro 蛋白可能對SLE的發生發展有一定作用，是影響SLE疾病的重要靶標分子之一。

PTPN22是一種淋巴特異性磷酸酶（Lyp），可抑制T細胞活化；當PTPN22第620位精氨酸（R）突變成色氨酸（W）時，PTPN22活性增強，可抑制T 細胞受體（TCR）的信號傳導，從而促進自身免疫的發展［9］。PTPN22突變體PTPN22-R620W（LypW）在多種自身免疫疾病中起重要作用，比如SLE［10］、類風濕關節炎［11］等。SLE患者血清干擾素（IFN）-α水平升高，且IFN 驅動的下游基因表達增高［12］。然而，攜帶PTPN22 突變體LypW 的SLE 患者與非攜帶SLE患者血漿IFN-α水平無明顯差異，但攜帶LypW的患者產生Toll 樣受體（TLR）7 誘導的Ⅰ型IFN 能力降低，提示攜帶LypW 的SLE 患者可能存在Toll樣受體或漿細胞樣樹突細胞依賴的宿主防御或抗炎功能缺陷［13］。PTPN22 是circ-PTPN22 的親本基因，推測circ-PTPN22 可能與其親本基因之間有相互作用或者具有類似PTPN22的作用。在后續研究中，我們將對circ-PTPN22與PTPN22相互作用進行深入研究，探索circ-PTPN22的作用機制，研究circ-PTPN22 或circ-PTPN22pro 蛋白在SLE 中的作用及機制。

志謝陸軍軍醫大學免疫學教研室楊玓老師和田志強老師；西南醫院中西醫結合風濕免疫科和體檢中心

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突