BHK-21細胞懸浮馴化及對新城疫病毒懸浮培養工藝研究

徐宏軍，張凌云，侯野，姜磊，董婷婷，鄭杰，張乾順，馬寧寧*

(1.青島蔚藍生物制品有限公司，山東青島 266114；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東青島 266114;3.北京鼎持生物技術有限公司，北京 100176)

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性、烈性、病毒性傳染病，對養禽業危害極大，被世界動物衛生組織(OIE)列為對動物危害最大的A類傳染病之一。該病的主要特征是呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血[1-2]。易感雞群一旦被速發性噬內臟型新城疫病毒所傳染，可迅速傳播并呈毀滅性流行，發病率和死亡率可達90%以上。新城疫首先于1926年于英國的新城發現，該疾病傳播迅速，2010年在80個國家中證實有NDV感染的病例。在2002～2003年間，由于美國加利福尼亞州暴發新城疫，撲殺的禽類達300萬只，直接經濟損失超過1.6億美元[3]；2009～2010年間，新城疫疫情使得印度尼西亞商品雞的死亡率達到了70%～80%[4]。在中國，從1946年通過病毒分離證實了新城疫在我國的存在和流行，就不斷有禽類感染的報道。直到新城疫弱毒株的發現和新城疫弱毒疫苗(Hitchner B-1和La Sota)的應用開啟了新城疫防控的新紀元，使得新城疫的傳播得到了一定程度的控制。在我國，使用低毒力活疫苗和油佐劑滅活疫苗已成為養禽業防治雞新城疫的常規措施。目前國內雞新城疫疫苗的生產主要依靠傳統的“雞胚法”工藝實現。此工藝大規模生產時存在雞胚質量不穩定及潛在外源病毒污染問題，收獲完成后，廢胚難于無害化處理，存在散毒風險和污染環境問題。以轉瓶培養哺乳動物細胞制備疫苗的方法雖然克服了上述缺點，卻存在細胞生長過程不易控制、病毒效價難以提高、收獲過程復雜，大規模生產勞動強度大，勞動效率低等劣勢[5]。

無血清懸浮培養技術生產疫苗屬于第三代疫苗生產方式，已應用于禽流感和圓環等病毒的懸浮培養[6-7]。該技術具有容易放大、細胞培養基不含有血清成分(可避免由于血清批次不穩定，外源病毒污染和嚴重免疫反應等問題)、自動化程度高、抗原培養滴度高等諸多優點。而目前新城疫疫苗的規模化生產仍以雞胚培養為主，新城疫的細胞培養大多數還停留在貼壁培養水平，本研究擬對BHK貼壁細胞進行懸浮馴化，以獲得能夠穩定生長并滿足新城疫大規模生產要求的懸浮細胞。并應用生物反應器系統對全懸浮培養條件下影響新城疫病毒La Sota株病毒產量的關鍵工藝參數進行了摸索、優化和確定；用獲得的NDV La Sota株細胞懸浮培養工藝進行工業生產放大，以期為該工藝后續的產業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與毒種 BHK-21細胞由北京鼎持生物技術有限公司提供。雞新城疫病毒La Sota株由青島蔚藍生物制品有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 MEM培養基和新生牛血清均購自GIBCO公司，BHK105、BHK106培養基由壹生科(深圳)有限公司提供，TPCK胰酶購自Sigma公司。

1.1.3 主要設備 5 L生物反應器Sartorius stedim(賽多利斯)Biostat?A、16 L生物反應器，購自廣州齊志生物工程設備有限公司；50 L生物反應器購自上海奧星制藥技術裝備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞的懸浮馴化 復蘇1支BHK-21細胞，用含10%新生牛血清MEM培養基按常規方法傳代，細胞生長穩定后，用含2%新生牛血清BHK105培養基將細胞數調整至0.5×106cells/mL，并轉移至搖瓶中，連續傳代至細胞生長穩定，細胞密度大于2×106cells/mL，活率>95%，認為BHK-21細胞已適應低血清培養基培養。

取處于對數生長期已適應低血清懸浮培養的BHK-21細胞接種于無血清懸浮培養基BHK105中，初始密度為0.5×106cells/mL連續傳代至細胞生長穩定，細胞密度大于2×106cells/mL，活率>95%，認為BHK-21細胞已適應無血清培養基培養，命名為“BHK-21-sc”。

1.2.2 BHK-21-sc細胞增殖的穩定性 取馴化后細胞，調整初始密度0.5×106cells/mL，連續傳代20代，每72 h取樣測定細胞密度和細胞活率，對細胞傳代穩定性進行監測。

1.2.3 BHK-21-sc懸浮培養生長動力學曲線 在5 L生物反應器中按照起始細胞密度0.5×106cells/mL、溶氧DO為40%、攪拌速度為150 r/min、pH為7.0，溫度為37 ℃的培養參數進行3個批次的BHK-21-sc的懸浮培養168 h，每24 h取樣進行細胞密度和細胞活率測定，并繪制BHK-21-sc懸浮培養生長動力學曲線。

1.2.4 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝研究 按照BHK-21-sc懸浮培養工藝培養細胞，進行NDV La Sota株的懸浮培養工藝研究。①接毒量及收獲時間：分別按MOI 0.0001、0.001、0.005、0.01接種雞新城疫病毒La Sota株，分別于48、60、72、84、96 h收獲病毒液；②TPCK胰酶添加量：添加終濃度為3、5、7、9 μg/mL TPCK胰酶進行病毒增殖；③培養溫度：接毒后培養溫度分別設置為30、33、37 ℃，確定最佳病毒培養溫度。在優化各參數時，其他對應參數固定不變。收獲的NDV病毒液進行HA和TCID50效價檢測，以確定最佳病毒培養工藝參數。

1.2.5 雞新城疫病毒LaSota株懸浮培養工藝驗證 在5 L反應器中培養細胞，密度達到6.0×106cells/mL以上，按照優化后確定的病毒接種量、TPCK胰酶添加量和病毒培養溫度進行病毒懸浮培養，按優化后確定的病毒收獲時間，收獲病毒液并進行HA、TCID50測定。按上述操作重復培養3批，驗證該工藝的穩定性。

1.2.6 新城疫La Sota株懸浮培養逐級放大工藝研究與驗證 以優化好的BHK-21-sc細胞懸浮培養工藝在5 L生物反應器中進行BHK-21-sc細胞懸浮培養，細胞培養72 h，待細胞密度達到要求后，按生物反應器常規轉罐技術操作，轉入16 L生物反應器進行二級培養72 h，細胞培養密度達到要求后，部分細胞轉入50 L生物反應器進行三級培養，剩余細胞按優化確定的新城疫La Sota株懸浮培養參數進行病毒培養。當50 L生物反應器細胞培養72 h，進行病毒培養，培養參數與16 L反應器一致，收獲病毒液測定病毒含量。按照以上方法重復開展3批新城疫La Sota株懸浮培養，進行逐級放大工藝驗證。

2 結果與分析

2.1 細胞馴化及傳代 貼壁培養的BHK-21細胞用低血清細胞培養基在125 mL搖瓶中在進行連續傳代6～8代后逐步適應，生長速度逐步變快，倍增時間逐步規律，細胞密度可達2×106cells/mL以上，獲得了適應低血清懸浮培養的BHK-21懸浮細胞。將已適應低血清培養基培養的BHK-21懸浮細胞，用無血清細胞懸浮培養基培養傳代8～10代后逐步適應，生長速度逐步變快，倍增時間逐步規律，獲得了適應無血清懸浮培養的BHK-21懸浮細胞，將之命名為BHK-21-sc細胞。BHK-21-sc細胞呈圓形、飽滿、光滑，輪廓清晰、大小均一，分布均勻，培養液清亮，均為單一細胞，未見結團現象(圖1)。圖1中a為貼壁培養的BHK-21細胞，b為初始低血清懸浮培養的BHK-21細胞，c為適應低血清懸浮培養的BHK-21細胞，d為初始無血清懸浮培養的BHK-21細胞，e為適應無血清懸浮培養的BHK-21-sc細胞。

圖1 細胞馴化不同階段細胞狀態圖(100×)Fig 1 cell domestication at different stages (100×)

2.2 BHK-21-sc懸浮細胞增殖的穩定性 為驗證該馴化細胞的穩定性，將馴化后細胞按初始密度0.5×106cells/mL連續傳20代，細胞生長穩定，培養72 h細胞密度均在5×106cells/mL以上，細胞活率大于95%。穩定性結果見圖2。

圖2 BHK-21-sc懸浮細胞增殖的穩定性Fig 2 Stability of BHK-21-sc suspension cell proliferation

2.3 BHK-21-sc細胞懸浮培養生長動力學曲線 在5 L生物反應器上，對BHK-21-sc細胞株培養168 h，繪制BHK-21-sc細胞株的懸浮培養生長曲線。結果表明：3批次細胞培養72 h后，細胞密度均可達到6.0×106cells/mL以上，細胞活率均達97%以上，證明該懸浮細胞生長穩定，能夠滿足BHK-21-sc細胞株的懸浮培養工藝需求，結果見圖3。

圖3 BHK-21-sc細胞株在5 L生物反應器中的生長曲線Fig 3 Growth curve of BHK-21-sc cell line in 5L bioreactor

2.4 接毒量及收獲時間的優化 分別以不同MOI接種La Sota株，接毒后48 h開始不同時間取樣繪制4批病毒增殖曲線。曲線圖可見接毒后72 h，病毒效價達到最高峰，隨后病毒滴度逐漸下降。接毒劑量MOI=0.005和MOI=0.01時培養72 h，病毒滴度相當，但較其他組病毒含量高，考慮生產實際的效率與成本問題，本試驗確定最佳接種和收獲條件為以MOI=0.005的接種量接種培養72 h收獲病毒液。結果見圖4。

圖4 不同接毒量接種BHK-21-sc細胞不同收獲時間的病毒含量測定Fig 4 Virus titers of BHK-21-sc cells inoculated with different dose at different harvest time

2.5 TPCK胰酶添加量的優化 以MOI=0.005接毒，添加不同的胰酶量后培養72 h進行病毒效價檢測，結果表明TPCK胰酶終濃度為5 μg/mL時，收獲抗原HA為9log2，病毒含量為106.17TCID50/0.1mL，較其他胰酶添加量接種的病毒滴度高。確定5 μg/mL的TPCK胰酶濃度為最佳添加胰酶濃度。結果見表1。

表1 不同TPCK胰酶添加量接毒的病毒產量比較Tab 1 Comparison of viral production withdifferent TPCK trypsin dosage

2.6 接毒后培養溫度的優化 以不同培養溫度進行病毒增殖，由病毒增殖結果可見，30 ℃和37 ℃較33 ℃病毒增殖效果差，故確定33 ℃為最佳培養溫度。結果見表2。

2.7 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝驗證 利用前期實驗優化獲得的最優懸浮培養工藝參數組合，進行3批次病毒懸浮培養，驗證雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝的穩定性。結果表明：3批次懸浮培養病毒液HA均不低于9log2，病毒含量均不低于106.13TCID50/0.1mL，證實建立的雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝科學、可靠、穩定。結果見表3。

表3 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝重復性驗證Tab 3 Repeatability verification of suspension culturetechnology of NDV La Sota strain

2.8 雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝放大 用5L-16L-50L反應器對BHK-21-sc細胞進行逐級放大培養，放大工藝中3批細胞增殖曲線較為接近，細胞生長穩定。雞新城疫病毒La Sota株在16、50 L中經3批次的培養，72 h后，收獲病毒液，HA滴度均可達9log2，病毒含量均可達106.0TCID50/0.1mL以上，與5 L生物反應器培養效果基本一致，說明雞新城疫病毒La Sota株懸浮培養工藝可穩定逐級放大到16、50 L生物反應器，工藝重復性好、科學穩定。結果見圖5、表4。

圖5 5、16、50 L生物反應器內BHK-21-sc細胞的增殖曲線Fig 5 Proliferation curves of BHK-21-sc cell in 16L and 50L bioreactors

表4 16、50 L生物反應器內工藝放大病毒增殖結果Tab 4 Amplification results of virus proliferation in 16 L and 50 L bioreactors

3 討論與結論

我國獸醫生物制品行業多采用雞胚接種收獲尿囊液的方式制備新城疫抗原，但雞胚接種制備疫苗抗原存在諸如雞胚來源不固定、有外源病毒污染可能等因素，而無血清懸浮培養可以有效提高單位體積內的細胞量，并能夠增加批次間的穩定性，是目前抗原培養的發展方向。應用新型現代化的細胞懸浮培養工藝制造動物疫苗抗原也是當前我國動物疫苗的主流發展趨勢之一。BHK細胞是指幼年敘利亞地鼠腎細胞(Baby Hamster Syrian Kidney)，1961年建株，它廣泛用于增殖各種病毒，生產獸用疫苗。通過優化懸浮BHK-21細胞的培養工藝能夠使其達到工業生產的水平[8]，BHK-21懸浮細胞已應用于口蹄疫病毒的工業生產，生產規模達4000 L以上，顯著提升了口蹄疫抗原的品質[9-10]。

研究表明，新城疫病毒在BHK貼壁細胞中能夠穩定增殖[11]，建立成熟的可放大的新城疫懸浮培養工藝將能夠極大促進獸用疫苗的轉型升級。本研究通過對BHK-21細胞進行低血清和無血清兩個階段的懸浮馴化，篩選出能穩定傳代的BHK-21懸浮細胞系，由于貼壁至懸浮馴化過程中BHK-21細胞的生長特性會發生改變，因此，傳代穩定和能夠放大生產是實現細胞進行工業生產的必要條件，本研究懸浮馴化的BHK-21-sc細胞能夠穩定傳代并實現在反應器上生長，證實該細胞能夠作為新城疫懸浮培養工業生產用細胞。

科學穩定的病毒培養工藝參數是獲得均一、高品質和高免疫原性的抗原必要條件。本研究通過逐一優化病毒接毒量、TPCK胰酶添加量、病毒培養溫度及病毒收獲時間4個關鍵懸浮培養工藝參數，最終確定最佳病毒培養溫度為33 ℃、最佳接毒量為MOI=0.005、最佳TPCK胰酶添加量為終濃度5 μg/mL及最佳收獲時間為72 h，建立了雞新城疫病毒La Sota株的懸浮培養工藝。應用該工藝進行懸浮培養，病毒增殖效率最高，CPE達90%以上，收獲的病毒液HA效價可達9log2，病毒含量不低于106.0TCID50/0.1mL。連續3批重復性驗證結果顯示該懸浮培養工藝重復性好，穩定可靠。為適應大規模生產，本試驗還進行了懸浮工藝放大研究，在16 L和50 L生物反應器中逐級放大連續培養的3批BHK-21-sc懸浮細胞，病毒增殖曲線與5 L培養的細胞增殖曲線相近，用優化后的新城疫病毒培養工藝在接毒后72 h達到病毒效價高峰，收獲的病毒液HA效價可達9log2，病毒含量均不低于106.0TCID50/0.1mL，證實了該懸浮培養工藝的穩定性和可放大性，具有廣泛的發展前景，為最終全面提高新城疫疫苗質量奠定了基礎。

本研究通過懸浮培養馴化和篩選獲得了形態良好、穩定傳代的BHK-21-sc懸浮細胞株；該細胞以初始密度0.5×106cells/mL接種，培養72 h可增殖到6×106cells/mL左右，細胞活率達95%以上。同時獲得了雞新城疫病毒La Sota株的全懸浮細胞培養工藝：病毒接種劑量為MOI 0.005，TPCK胰酶添加終濃度為5 μg/mL，最佳培養溫度33 ℃，培養時間72 h。應用該細胞懸浮培養工藝在5、16、50 L反應器上懸浮培養BHK-21-sc懸浮細胞株生產雞新城疫病毒HA滴度不低于9log2，病毒含量不低于106.0TCID50/0.1mL。表明BHK-21-sc細胞無血清全懸浮生產雞新城疫病毒工藝穩定，可以實現逐級放大和規模化生產。