牛奶中獸藥殘留限量新國標及主要檢測方法的國內外比較分析

解書斌，韓偉，閻玉林，于忠娜

(1.青島農業大學海都學院，山東萊陽 265200；2.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島 266109；3.青島海關技術中心，山東青島 266002；4.青島譜尼測試有限公司，山東青島 266100)

Turnipseed SB等[1]提出獸藥是一類應用廣泛的藥物，具有許多不同的化學和治療特性。獸藥殘留是指在動物中使用獸藥可能會使母體化合物、代謝產物或結合物的殘基留在經治療的動物衍生的食品中，牛奶中的獸藥殘留是養殖過程中獸藥濫用導致的。獸藥殘留過量對人體健康有著嚴重影響，若長期食用獸藥殘留超標的食品，則可能導致人體獸藥殘留蓄積，引起人體毒害損傷，以及病原體耐藥性的產生，甚至致畸、致癌[2]。為應對牛奶中獸藥殘留超標問題世界各國和組織都已制定了相關的法律法規和監控體系。我國于2019年9月6日發布，即將于2020年4月1日正式實施的食品安全國家標準GB 31650-2019[3]重新修訂了食品中獸藥最大殘留限量標準，替代農業部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》相關部分。本文重點對獸藥殘留的種類以及獸藥最大殘留限量值、檢測方法等方面進行分析。

1 牛奶中獸藥殘留的種類及最大殘留限量

1.1 GB 31650-2019對牛奶中獸藥殘留規定 本標準規定了牛奶中阿苯達唑等81種獸藥的最大殘留限量，對81種獸藥按照其用途分類，共涉及五種獸藥類型，分別為抗菌類、抗寄生蟲類、激素類、消炎鎮痛類、農藥除蟲類，具體結果見圖1。標準中所規定的抗菌類獸藥數量最多，有37種，占國標所涉及獸藥種類的45.7%。抗菌類藥物有10種不同類型，包括β-內酰胺類(9種)、氨基酸糖苷類(6種)、喹諾酮類(4種)、大環內酯類(4種)、四環素類(4種)、多肽類(2種)、磺胺類(2種)、酰胺醇類(2種)、林克胺類(2種)，以及抗菌增效劑(2種)。其次為抗寄生蟲類獸藥有25種，約占標準涉及獸藥種類的30.9%，其中抗線蟲類藥物最多，有12種；其次為抗吸蟲和球蟲藥物各4種，抗錐蟲、滴蟲、梨形蟲藥物相對較少，分別為2種、2種、1種；農業除蟲類獸藥有9種，約占涉及獸藥種類的11.1%；激素類藥物有6種，約占涉及種類的7.4%，其中糖皮質激素類藥物有2種，性激素藥物3種；神經類藥物3種，約占3.7%；消炎鎮痛類藥物1種，僅占1.2%。

圖1 81種獸藥殘留最大殘留限量種類數量比較Fig.1 Comparison of the number of 81 types ofveterinary drug residue maximum residue limits

1.2 GB 31650-2019牛奶中獸藥殘留規定與農業部公告第235號比較分析 自2002年中華人民共和國農業部公告第235號發布到如今已有17年，第235號公告對59種牛奶中獸藥檢出最大限量做出了標準，食品安全國家標準GB 31650-2019對第235號公告做出了補充及修改，增加了23種牛奶獸藥殘留檢出最大標準，具體見表1。增加的牛奶獸藥最高檢出限量標準中以抗寄生蟲類獸藥為最多，有12種；抗菌類藥物有5種，其中大環內酯類抗生素2種；農業除蟲劑4種；激素以及消炎鎮痛類各1種。同時GB 31650-2019對7種牛奶中獸藥殘留檢出最高限量進行了修改。新國標增加了多拉菌素、新霉素、泰樂菌素的獸藥殘留最大檢出標準，其中新霉素、泰樂菌素的最高檢出限分別增加了200%和100%，多拉菌素由牛奶中不得檢出更改為最大檢出限量為15 μg/kg，而農業殺蟲類藥物辛硫磷在新國標中卻未做最大檢出限量規定，具體見表2。

表1 新國標相比舊國標新增獸藥檢出限標準Tab 1 New veterinary drug detection limit standardscompared with the old national standard

表2 新國標與第235號公告獸藥檢出限變化Tab 2 New national standards and announcementNo.235 changes in detection limits of veterinary drugs

1.3 我國與國外主要乳品貿易國家獸藥殘留檢出標準比較分析 為保障國內和國際乳品流通的安全性，保障人民身體健康，全球各國與組織都對牛奶中獸藥殘留最大檢出限量做出了規定，乳品質量安全不達標，獸藥殘留檢出過量的產品禁止進入市場并禁止國際流通。針對牛乳中獸藥殘留檢出限量問題，共搜集了7個世界上主要的乳品貿易國家及組織規定的牛奶中獸藥殘留檢出限量標準，從規定獸藥的種類、數量等方面進行了分析。

不同國家和組織所規定的牛奶中獸藥殘留限定的數量之間有較大的差異，如圖2所示。日本是所調查國家或組織中規定獸藥殘留限定數量最多的國家，2019年日本肯定列表中所規定的獸藥殘留數量高達355種[4]；澳大利亞位居其次，2019年規定了319種獸藥殘留限量[5]；歐盟規定了牛奶中111種獸藥殘留限量[6]；中國新國標規定牛奶中獸藥殘留限量數量為81種，緊隨其后；新西蘭2019年所規定牛奶中獸藥殘留數量為55種[7]；2018年加拿大獸藥署以及國際食品法典委員會CAC(Codex Alimentarius Commission)修訂獸藥殘留標準(CX/MRL 2-2018)，兩者規定的限定數量相當，分別為37、36種[8-9]。

圖2 主流國家或組織規定牛奶中獸藥殘留最大殘留限量種類數量比較Fig 2 Comparison of the number of types of maximumresidue limits for veterinary drug residues in milkregulated by mainstream countries or organizations

本文還對各牛奶生產銷售主流國家及組織的不同用途的獸藥種類數量進行了比對分析，結果見圖3。不同國家或組織對不同類型獸藥殘留的限量數量的規定各不相同，各國及組織對抗菌藥的規定數量所占比重普遍較大，除了日本、澳大利亞所占比例較低，分別為30.4%、28.8%，其余國家或組織抗菌藥物所占比例均已達到45.0%以上。中國僅次于加拿大以及CAC，所占比例為45.7%；其次為殺蟲劑和抗寄生蟲類藥物，其中殺蟲劑類藥物除加拿大并未對獸藥殘留限量作規定外，其余各國、組織規定限量數量占比均在10.0%以上，日本和澳大利亞更是占到了32.4%和26.0%，而中國只占11.1%；抗寄生蟲類藥物各國、組織規定限量數量差異較大，中國、CAC所占比例最高分別為30.9%和24.3%，而日本、澳大利亞、新西蘭三個國家抗寄生蟲藥規定限量數量占比較低，分別為0.48%、5.6%、7.3%；除草劑類藥物，僅有日本、澳大利亞、新西蘭有所涉及，特別是澳大利亞和日本除草劑類藥物規定限量數量占比高達34.5%和21.4%，新西蘭為16.4%；激素類藥物，除新西蘭外各國或組織都有涉及，其中中國占比最大，為7.4%，歐盟和CAC位居其次為5.4%，日本、澳大利亞兩國規定激素類藥物限量數量分別為6種和1種，所占比例僅為1.7%和0.3%；植物生長調節劑類藥物，僅有日本、澳大利亞兩國做出了限量規定，其余幾國或組織并未涉及；此外本文所涉及到的所有獸藥種類，僅有日本、澳大利亞涉及到了全部7種獸藥類型，其他國家或組織主要對除草劑以及植物生長調節劑類藥物沒有涉及。

圖3 不同用途獸藥殘留在各個國家或組織中的分布比較Fig 3 Distribution comparison of veterinary drug residues for different purposes indifferent countries or organizations

2 牛奶中主要獸藥殘留檢測方法比較

近年來食品安全問題越來越引起人們的重視，國家雖然對動物用藥限量已有了明確規定，但農場為追求經濟效益、減少損失，依然會不顧風險加大用藥量，牛奶中的獸藥殘留問題也日漸嚴重，獸藥殘留的檢測方法更是得到了極大的發展與完善，目前國內外關于牛奶中獸藥殘留的檢測方法主要分為4大類[10]：儀器分析法、免疫法、適應體傳感器檢測法以及微生物法。

2.1 儀器分析法 儀器分析法是檢測牛奶中獸藥殘留應用最廣泛的方法，該方法根據獸藥中的特異性基團或標志性物質的反應等來測定其含量。儀器分析法需要對樣品進行復雜的前處理，迫使獸藥特異性基團或標志性物質與牛奶中成分分離[11]，而后用儀器進行定性或定量分析。現行儀器分析法主要包括色譜法和光譜法[12]。色譜法主要有：氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質譜聯用法(GC/MS、GC/MS-MS、LC/MS、LC/MS-MS、TLC/MS)。光譜法主要有：近紅外光譜法(FT-NIR)、中紅外光譜法(FT-MIR)。國內多采用氣相色譜和質譜(GC-MS)聯用技術定性和定量分析食品中殘留物，對于熱不穩定的化合物則用HPLC-MS技術進行確認分析。歐盟采用色譜分離與放免技術的聯用和免疫親和色譜等技術來分析動物組織中的抗生素、黃曲霉毒素、激素和β-激動劑等[13]。2013年Cámara等[14]建立了一種利用高效液相色譜結合二極管陣列檢測器可同時檢測多種β-內酰胺類獸藥的方法。獸藥殘留檢出限達到3.4～8.6 μg /L，滿足國家最低殘留限量的要求。Yu等[15]建立了一種簡單、靈敏、高效的牛奶和奶粉中獸藥殘留檢測技術，該方法利用C18攪拌棒吸附萃取技術結合高效液相色譜-串聯質譜技術可對牛奶中6種磺胺類藥物實現快速檢測。Lv 等[16]建立了一種利用固相萃取結合高效液相色譜檢測樣品中四環素類藥物殘留的新方法。

2.2 微生物檢測法 微生物檢測法又叫做微生物抑制試驗(microbial inhibitions test, MIT), 牛奶中的殘留物微生物抑制劑測試最早可追溯到1952年。該方法主要應用在抗生素殘留量的檢測[17]，由于抗生素能對微生物的新陳代謝和生理機能產生抑制作用，所以可以用來檢測并計算出牛奶中獸藥殘留量，檢測方法主要有三種：微生物抑制法、微生物受體法和酶比色法，常見的檢測方法有氯化三苯基四氮唑法(TTC法)和微生物受體檢測法等[18]。MIT法是以嗜熱脂肪芽孢桿菌為指示菌，該菌對多種抗生素十分敏感，而對青霉素類和頭孢菌素類尤為敏感。我國較早和較多使用的是荷蘭DSM Foods公司的戴爾沃系列，該系列MIT試劑盒最早開發于50年代，目前已成為全球公認的乳品抗生素殘留的檢測方法[13]。TTC法適用于能殺滅或抑制嗜熱乳酸鏈球菌的各種常用抗生素或消毒劑的檢驗, 最初選擇嗜熱乳酸鏈球菌是因為此菌對牛乳中青霉素較為敏感, 該方法1955年4月1日起在我國生效為法定方法，并最終被GB/T 4789.27-2008替代。

Kumar等[19]利用微生物檢測法對牛奶中的萌芽芽孢和休眠孢子進行了獸藥殘留抑制實驗，來判定并檢測獸藥殘留情況。該項研究表明此方法或可以用于奶制品產業，但因檢測靈敏性與選擇性較差，僅能做半定量的檢測。Samsonova等[20]建立了檢測多種不同類型食品中獸藥(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)殘留的方法并選擇了微生物抑制法、免疫法、以及生物傳感器檢測法，對三種方法的優劣進行了比較分析，論述了未來獸藥殘留檢測方法的發展趨勢。Yamaki等[21]使用微生物檢測法對西班牙的一個牧場中的羊奶中殘留的獸藥進行了分析，結果表明樣品中的陽性率為2.6%，其中β-內酰胺類獸藥大約為25%，但是該方法存在一定的假陽性，且靈敏度有待提高。

2.3 免疫法 免疫法是根據抗體與抗原之間的高選擇性特異結合為基礎而建立的檢測方法[22-23]。抗原與抗體間的結合具有高度的敏感性與特異性，根據標記抗體或抗原與對應適配體進行反應呈現出的函數關系，此方法可以對牛奶樣品中的獸藥殘留進行定性或定量分析。利用免疫法原理建立的一系列便捷、高效的檢測方法已被廣泛應用于牛奶獸藥殘留檢測[24]。最常見的有快速檢測試紙卡、放射免疫測定法(Radioimmunoassay,RIA)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA試劑盒法)。目前分析ELISA試劑盒正在興起，并不局限于乳品抗感染藥物的檢測，其他獸藥如激素殘留、抗寄生蟲藥物，以及農藥殘留、微生物毒素殘留都已有針對的ELISA試劑盒。2001年12月國家質量監督檢驗檢疫總局推薦Randox公司的ELISA試劑盒作為動物激素、抗生素殘留的首選篩選試劑。Charm Ⅱ 7600是現有的快速放射性檢疫檢測技術中最為成功的例子。該檢測系統就是利用細菌的專一性受體來識別、結合同一類抗生素族中的母環為工作原理而建立起來的、較為快捷的生物放射檢測技術，能同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況, 是現有的快速放射性檢疫檢測技術中最為成功的例子。目前Charm Ⅱ 7600檢測系統對β-內酰胺類、氯霉素類、四環素類、磺胺類、鄰氯青霉素及堿性磷酸酶等7項檢測已被FDA認證[13]。2016年Chen等[25]建立了熒光偏振免疫分析法，通過異硫氰酸熒光素標記的獸藥，在黑暗條件，示蹤劑與抗體結合，然后測量加入不同濃度的藥物與示蹤劑競爭結合抗體后的熒光偏振值，進而高靈敏度檢測奶制品中克林沙星的殘留。Pennacchio 等[26]利用免疫傳感器方法檢測牛奶中的青霉素G，該方法可以直接地應用于檢測牛奶中青霉素G的殘留，而不受其他物質的干擾。

2.4 適應體傳感器檢測法 核酸適配體概念的提出最早可追溯到1990年[27]。核酸適配體能與多種目標物實現特異性結合，適配體與靶向目標物結合后會發生結構上的改變，根據核酸適配體的這一特性，可用適配體作為探針檢測多種目標物，包括霉菌毒素、獸藥殘留、重金屬等[28-29]，由于適配體是一段特定DNA序列，可不受自然及物理條件約束直接體外合成并且其結構穩定，現已受到研究人員廣泛關注[30]。2013年Sun等[31]開發了一種基于石墨烯-納米金離子等多種復合材料之間協同的適配體傳感器，該適配體傳感器可用于牛奶中卡那霉素的檢測。

3 展 望

自2002年中華人民共和國農業部公告第235號發布到如今已有17年，第235號公告對59種牛奶中獸藥檢出最大限量做出了標準，2019年9月6日發布，即將于2020年4月1日正式實施的食品安全國家標準GB 31650-2019對第235號公告做出了補充及修改，增加了23種牛奶獸藥殘留檢出最大標準，并對7種獸藥殘留檢出最大限量做出了修改，進一步完善了國內獸藥使用規范和標準，而對比世界上主要乳品貿易國家如日本、澳大利亞的限量規定數量上還有一定的差距，特別是在除草劑類藥物和殺蟲劑類藥物的限量規定上，國內沒有規定或是規定比例較少。

近年來食品安全問題越來越受重視，隨著科技的發展和生物化學領域的不斷探索，人類為應對動物性疾病做出了諸多努力，特別是在動物疾病用藥方面，新型特效藥物不斷研發制造，這就導致了獸藥數量繁多，國家標準法規更新不及時，內容涵蓋不全，從而使食品生產廠家無法規可依，無標準參照。同時農場為追求經濟效益、減少損失，依然會不顧風險加大用藥量，牛奶中的獸藥殘留問題得不到根本的解決，為應對獸藥殘留問題，應盡快完善食品獸藥殘留法規、最大殘留限量標準和監管體系，積極有效的控制牛奶中獸藥殘留問題。