牛蒡子粉中牛蒡苷元在仔豬體內的藥物動力學研究

冉志平，吳利軍，楊文海，陳潔，陳夏冰，邵志勇，金爾光，周華，童偉文，李杰，何斌

(武漢市農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430208)

牛蒡子是一種常用中藥，性寒，味辛、苦，歸肺、胃經，具有疏散風熱、宣肺透疹等功效，獸醫臨床上用于治療外感風熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥[1]。牛蒡子的主要有效成分為木脂素類化合物，包括牛蒡苷和牛蒡苷元等[2]，牛蒡苷在胃腸道微生物作用下轉化為牛蒡苷元發揮藥理作用[3]，即牛蒡苷元為牛蒡子的直接有效成分[4]。牛蒡苷元具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗糖尿病[8]等眾多藥理作用，具有良好的研發和應用前景；本文研究了靜脈注射牛蒡甘元和牛蒡子粉灌胃給藥后在仔豬體內的藥物代謝動力學特征，為新獸藥的研發和臨床用藥提供理論依據和參考，為中獸藥現代化進行有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 牛蒡苷元標準品(批號：160509)含量≥98.1%，由上海融禾醫藥科技有限公司生產；準確稱取牛蒡苷元標準品，甲醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元1.0 mg/mL的標準貯備液。牛蒡子粉由牛蒡子經100目粉碎而得，牛蒡子粉中牛蒡苷元和牛蒡苷含量采用中《華人民共和國獸藥典》推薦方法經實驗室檢測，含牛蒡苷元0.33%、牛蒡苷4.33%，購于武漢九州通醫藥集團股份有限公司。乙腈、甲醇色譜級，購自美國 Themo公司；二氯甲烷、丙二醇等分析純，購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器 1200型高效液相色譜儀，自動進樣器、紫外檢測器，美國AgiLent公司；D3024R 高速離心機，SCILO-GEX公司；電子天平(±0.0001 g)，德國賽多利斯公司；N-EVAPTM111型氮吹儀，美國路易公司。

1.1.3 動物 杜長大仔豬8頭，雌雄各半，編號1-8號，體重：30.0±5.0kg；購于武漢博牧生物科技有限公司。試驗前正常飼養觀察1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的全價日糧。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為AgiLent SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為280 nm；流動相為甲醇：乙腈：水(31∶20∶49，V∶V∶V)；流速為0.8 mL/min；進樣量為30 μL；柱溫為(30±0.1)℃[9，10，11]。

1.2.2 血漿樣品處理 將血漿樣品從-20℃冰箱中取出，室溫下自然解凍，準確吸取0.5 mL于5.0 mL離心管中，加入2.0 mL二氯甲烷，渦旋振蕩60 s后以10000 r/min離心10.0 min吸取二氯甲烷層，同法提取兩次，合并兩次二氯甲烷層，置于15.0 mL離心管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用200 μL流動相溶解，10000 r/min離心10.0 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后以30 μL進樣分析，記錄色譜圖[12-14]。

1.2.3 血漿標準曲線的建立 向7支5.0 mL聚丙烯離心管中各加入500 μL空白血漿，然后依次加入一系列已稀釋好的牛蒡苷元標準工作液，得到藥物濃度依次為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的血漿樣品。分別按照血漿樣品處理方法處理，進行HPLC分析，記錄色譜圖。以測得的牛蒡苷元峰面積(x)為橫坐標，濃度(y)為縱坐標，建立血漿標準曲線，擬合回歸方程，求出相關系數(r)。

1.2.4 方法學驗證 取空白血漿500 μL置于5.0 mL聚丙烯離心管中，然后依次加入已稀釋好的牛蒡苷元標準工作液高、中、低三個濃度，充分混合均勻，配制成含牛蒡苷元濃度分別為5.0、1.0、0.1 μg/mL的血漿樣品，按照血漿處理方法進行處理，進行HPLC檢測分析，每個濃度一天內設置5個平行進行檢測，以考察日內變異系數；連續重復檢測5 d，以測定日間變異系數。并計算方法的回收率、準確度、精密度以及靈敏度。

1.2.5 藥物動力學試驗設計 給藥前12.0 h 禁食，對每頭仔豬進行稱重，并采集血樣作為空白對照。1-8號仔豬以每頭1.0 g/kg.bw的牛蒡子粉灌胃給藥。牛蒡子粉灌胃給藥后，每頭仔豬于0.167、0.333、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0 h采血5.0 mL左右；所采集血樣置于已加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r/min離心15.0 min分離血漿，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測定[15]。

1.2.6 豬血漿中藥物濃度的測定 將給藥后不同時間點獲得的血漿，按“血漿樣品的處理"方法處理后進行HPLC分析，計算牛蒡苷元的峰面積，代入標準曲線回歸方程，計算出血漿中牛蒡苷元的濃度。

1.2.7 數據分析 采用ExceL軟件分析處理方法學數據并繪制血漿標準工作曲線及藥-時曲線圖；藥物動力學模型擬合及參數計算均采用中國藥理學會數學專業委員會編制的3p97藥物動力學軟件分析。

2 結果與分析

2.1 牛蒡苷元在血漿中的色譜行為 在本研究所建立的方法下，牛蒡苷元保留時間為14.0 min，峰形對稱性良好，基線平穩，與雜質峰分離良好，檢測效率高。空白血漿色譜圖如圖1，空白血漿添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖如圖2，樣品(0.55 μg/mL)血漿色譜圖如圖3。

圖1 空白血漿色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma

圖2 空白血漿中添加牛蒡苷元(1 μg/mL)色譜圖Fig 2 Chromatogram of plasma with Arctigenin(1.0 μg/mL)

圖3 給藥后血漿中牛蒡苷元(0.55μg/mL)色譜圖Fig 3 Chromatogram of arctigenin in plasma(0.55 μg/mL) after administration

2.2 血漿標準工作曲線 牛蒡苷元標準品在0.05～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數r=0.9998，線性方程為y=0.0265x-0.0328(x表示牛蒡苷元的峰面積；y表示牛蒡苷元在血漿中的濃度)。牛蒡苷元在仔豬血漿中的標準工作曲線如圖4。

圖4牛蒡苷元在血漿中的標準工作曲線Fig 4 Calibration curve of Arctigenin in piglet plasma

2.3 方法學驗證結果 牛蒡苷元在仔豬血漿中的最低檢測限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。牛蒡苷元在0.05～5.0 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.0264x-0.0295，相關系數為r=0.9998。該方法回收率大于83.35%，日內變異系數均在3.51%以內，日間變異系數均在5.90%以內；仔豬空白血漿中添加牛蒡苷元的回收率和變異系數如表1和表2。

表1 豬空白血漿中添加ACT的回收率和日內變異系數考察結果(n=5)Tab 1 Intra-day recovery and precision values forthe determination of ACT in pig plasma(n=5)

表2 豬空白血漿中添加ACT的回收率和日間變異系數考察結果(n=5)Tab 2 Inter-day recovery and precision values forthe determination of ACT in pig plasma(n=5)

2.4 藥物動力學試驗數據 單劑量灌喂牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后，在仔豬體內的血藥濃度如表3，主要藥物動力學參數如表4，血藥濃度-時間曲如圖5。

圖5 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后牛蒡苷元在豬體內的藥物濃度-時間曲線Fig 5 The curve of drug concentration-time in pigs ofACT after a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

表3 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0 g/kg·bw)后牛蒡苷元在豬體內的血藥濃度(μg/mL)Tab 3 Blood concentration(μg/mL) of ACT in pigs after a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

表4 單劑量灌胃牛蒡子粉(1.0g/kg.bw)后在豬體內的主要藥物動力學參數(n=8)Tab 4 The main pharmacokinetic parameters in pigsafter a single oral dose of Fructus arctii powder(1.0 g/kg·bw)

灌胃牛蒡子粉后，牛蒡苷元在仔豬體內的血藥濃度-時間數據符合有吸收二室模型，藥時曲線出現雙峰，達峰時間(tmax)為0.853±0.211 h，峰濃度(cmax)為0.430±0.035μg /mL，吸收半衰期(t1/2ka)為0.274±0.102h、消除半衰期t1/2β為63.467±29.115 h，表觀分布容積Vd為1.680±0.402 L/kg，表明牛蒡子粉在仔豬體內吸收較快，分布較為廣泛，代謝消除極為緩慢。

3 討論與結論

牛蒡子粉灌胃給藥后，牛蒡苷元在仔豬體內的吸收半衰期t1/2ka(0.274±0.102 h)較短，達峰時間tmax(0.853±0.211 h)較快，表明其吸收迅速、達到最高血藥濃度時間較短；消除半衰期t1/2β(63.467±29.115 h)較長，表觀分布容積Vd(1.680±0.402 L/kg)較大，峰濃度cmax(0.430±0.035 μg /mL)相對較低，這與He 報道的大鼠口服牛蒡苷元后迅速分布到組織中的結論相符[13]。表明牛蒡苷元在仔豬體內消除較為緩慢，較大程度的分布到組織中，導致其在血液中的血藥濃度相對較低，可在仔豬體內較長時間發揮作用。

灌胃給藥后牛蒡子粉中牛蒡苷元的血藥濃度-時間曲線呈現明顯的雙峰，藥物第一次達峰時間(Tmax)為0.5 h，峰濃度(Cmax)為0.606±0.036 μg/mL，在1.5 h時第二次達峰，峰濃度(Cmax)為0.413±0.036 μg/mL，這與袁媛測定的牛蒡子水提物在小鼠體內的血藥濃度呈現雙峰現象相符，袁媛對牛蒡子水提物進行藥效動力學研究，發現在延長小鼠咳嗽潛伏期與抑制咳嗽次數方面也有兩個高峰，說明藥物的吸收過程比較特殊，且藥效與藥代動力學研究存在關聯，并分析雙峰原因可能是由水提物中牛蒡苷轉化成牛蒡苷元引起的，也有可能是肝腸循環引起[16]。

在中藥藥物動力學研究中，出現雙峰的現象較多，機理也比較復雜，這與中藥成分復雜以及相同母核的成分之間相互轉化等特點相關[17]。郭曉宇等[18]研究大鼠口服黃芩苷與黃芩素的藥物動力學研究發現二者血藥濃度-時間曲線均為雙峰，認為二者的雙峰現象可能是由黃芩苷在體內腸道菌群的作用下被水解成其苷元形式的黃芩素和腸肝循環引起，Shi 等[19]認為黃芩素的雙峰現象可能與相同母核成分之間的轉化有關。陽長明[20]對保心微丸中的肉桂酸成分在大鼠體內的藥物動力學特征進行研究，發現其血藥濃度-時間曲線為雙峰，認為肉桂醛在體內可氧化成肉桂酸，再次被吸收后使曲線呈現雙峰，也可能因為腸肝循環引起。

據此，本試驗給仔豬灌胃牛蒡子粉后，藥時曲線的雙峰現象很有可能是由牛蒡苷轉化為牛蒡苷元所致，血漿中所測得的牛蒡苷元一部分是由牛蒡子粉中所含的牛蒡苷元以原型吸收而來，另一部分是牛蒡苷在胃腸道菌群的作用下轉化為牛蒡苷元而來；也有可能是因為肝腸循環而導致第二峰的出現，也有可能是兩方面原因共同作用的結果，有關牛蒡苷元雙峰現象的具體原因有待進一步研究。