不同植物根際土壤碳氮水解酶活性熱點區的空間分布特征

劉 霜,張心昱,*

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室, 北京 100101 2 中國科學院大學資源與環境學院, 北京 100190

植物根際是植物與土壤微生物相互作用最活躍的界面,是研究根系與土壤微生物養分獲取機制的熱點場所[1]。在根際,受根系分泌物影響,土壤微生物大量富集,植物和微生物分泌的土壤酶能高效催化土壤有機質分解,如,β-葡萄糖苷酶(βG)降解纖維素,將纖維素二糖水解為葡萄糖,為根際土壤微生物提供能量；N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)降解幾丁質和肽聚糖,將殼二糖水解為氨基葡萄糖(葡萄糖胺),為植物和微生物提供氮養分。因為βG在纖維素降解,NAG在幾丁質降解中起同樣關鍵作用,并且是土壤碳、氮循環過程的代表性指示物研究最多[2- 3],因此本文以這兩種水解酶為代表進行根際土壤碳氮水解酶活性熱點區空間分布特征的研究[1]。植物根際酶活性熱點區的分布范圍可以代表根系和根際微生物所需能量和養分的空間范圍,而根際土壤的碳氮酶活性的特征則可用來揭示根系和根際微生物能量和氮養分獲取策略。

土壤酶活性已成為量化陸地生態系統土壤質量和功能的重要指標,而精確、合理、高效的測定方法是研究的基礎。常用的土壤酶活性測定技術測得的酶活性僅為土壤的最大潛在酶活性,不能準確反映原位土壤環境中的真實活性。土壤原位酶譜法的出現為研究植物根系和根際微生物的養分獲取策略提供了新方法[4]。利用土壤原位酶譜法,Razavi等發現酸性土壤種植的玉米和扁豆根際酶活性熱點區分布規律顯著不同,玉米由于根尖分泌物豐富,酶活性熱點區主要集中在根尖(大約2 mm),而扁豆無論是根尖還是根伸長區熱點區都是均勻分布(1—1.5 mm),這是由于扁豆根系各個部位都能與根瘤菌共生固氮,所以扁豆根系土壤微生物為了固氮而維持一種潛在的均質的根際環境[5]。Liu等通過土壤原位酶譜法研究了將有機肥施于青藏土壤表面或與土壤混勻兩種處理方式下青藏大麥根系的養分獲取機制,結果發現根際酶活性在有機肥施于土壤表面時比將有機肥與土壤混勻處理更高。這是因為有機肥與土壤混勻后植物和微生物要適應新的養分來源,降低根對土壤養分的吸收以及土壤微生物的活性[6]。Ma等通過土壤原位酶譜法發現水稻根際土壤磷酸酶熱點區范圍(3 mm)遠遠大于氮水解酶熱點區范圍(1.5 mm)[7],Razavi等也發現玉米和扁豆磷水解酶的熱點區范圍(2.5—3.5 mm)大于碳氮水解酶熱點區范圍(分別為1.5—2 mm和1—1.5 mm),這些結果也表明土壤中的有效磷相對匱乏,而磷是植物生長的關鍵因子以及細胞合成腺苷三磷酸(ATP)、核酸磷脂等的重要組分,所以根系和根際微生物對不同養分元素的需求不同[5]。

中國西南喀斯特土壤分布區是世界三大喀斯特土壤分布區之一,過去由于人地矛盾突出,坡地開墾為耕地,結果導致土壤侵蝕、養分淋失、土壤質量下降,影響植被恢復。20世紀初,中國政府在該區域坡度>15°的耕地實施退耕還林、還草政策,過去耕地以種植玉米為主,退耕后,大量雜草(如莎草)生長,部分農田退耕后種植牧草,如苜蓿。中國西南喀斯特土壤類型為石灰土,pH值7—8[8]。受根系分泌物影響,根際土壤酸化,土壤pH低于非根際土壤[9],根際土壤微生物活性更高,根系和根際微生物的養分獲取更高[10]。但是目前關于喀斯特植物根際不同部位土壤碳、氮酶活性熱點區的空間分布特征的研究較少,關于玉米、苜蓿和莎草根尖區和伸長區獲取碳、氮養分的機制尚不清楚。

本文采用典型喀斯特坡耕地0—20 cm土壤,選擇玉米、苜蓿和莎草進行室內根盒培養試驗,利用土壤原位酶譜法分析技術,分析不同植物根際土壤碳氮水解酶活性熱點區的空間分布規律。1)因為玉米根系比苜蓿和莎草更發達,根尖分泌物數量多,所以我們假設玉米根尖的根際酶活性熱點區范圍比莎草和苜蓿大；2)由于植物根尖分泌物比根伸長區更豐富,我們假設根尖的水解酶熱點區范圍要大于根伸長區；3)苜蓿為固氮植物,與非豆科的莎草和玉米相比,苜蓿根際土壤分泌氮水解酶獲取氮的需求較低,所以我們假設苜蓿氮水解酶的根際酶活性熱點區小于碳水解酶。本研究將揭示喀斯特植被根際土壤碳氮水解酶活性空間分布規律,可為喀斯特土壤退耕后植被的選擇、地下養分管理提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 研究區概況

土壤采集于貴州省普定縣陳旗小流域(26°15′N-26°16′N,105°46′E—105°47′E),平均海拔為1400 m。研究區屬于典型的亞熱帶季風氣候,年均溫15.1℃,年降水量1390 mm。最高溫7月,最低溫1月,雨季在5月—10月期間。根據中國土壤分類,本研究區土壤類型為石灰土,是美國發生分類的松軟始成土[11]。研究區主要農物是玉米、紅薯、大豆等[12]。

在2018年7月,選取2 m×2 m坡耕地樣方4個,每個樣方間距大于10 m,每個樣方采用5點混合的方法,采集0—20 cm土壤,將所有采集土壤樣品混勻。土壤含水量13%,pH值 8.27,土壤總碳含量36.7 g/kg,總氮含量2.78 g/kg,總磷含量487 mg/kg,可溶性有機碳含量29 mg/kg,銨態氮含量11 mg/kg,硝態氮含量12 mg/kg,有效磷含量4 mg/kg。

1.2 根盒培養試驗

采用室內根盒培養的方法,選擇3種植物,即當地糧食作物玉米(Zeamays)、牧草苜蓿(Cyperusrotundus)及退耕后常見植物莎草(Medicagosativa),在內尺寸為20 cm×20 cm×3 cm的根盒中培養,每種植物5次重復,總計15個根盒。將根盒能打開的一面向上水平放置,把過2 mm篩的土壤緩慢且均勻地填滿根盒,關閉根盒并垂直輕輕搖動土壤,避免土壤分層。用濾紙在室溫育種72 h,挑選長勢良好的種子,移種在根盒能打開面的土體表層距頂端1 cm處。將根盒向能打開面傾斜45°放置,保持室內溫度(20±1)℃和光照16 h,培養30 d。在培養期間,每天對根盒稱重,用蒸餾水補充水分,保持土壤含水量控制在田間持水量的60%左右。

1.3 根際土壤原位酶譜分析

在根盒培養30 d后,進行根際土壤原位酶譜分析實驗。主要參考Spohn和Kuzykov的方法[13]。用浸泡了含有甲基傘形酮(MUB)的底物溶液浸泡濾膜,當特定底物被專一水解酶分解后會釋放熒光物質,可以在紫外燈(Philips, TL-D 18W BLB)下顯色。βG活性采用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物,NAG活性用4-甲基傘形酮酰-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷為底物。將每種底物分別溶解于10 mmol/L MES(化學分子式：C6H13NO4SNa0.5)緩沖溶液中,緩沖液的pH為8.27,與土壤pH一致。用尺寸為10 cm×10 cm,孔徑為0.45 μm尼龍濾膜(桃園 N66親水尼龍微孔濾膜)浸滿底物,打開根盒,將浸滿βG、NAG底物的濾膜依次覆蓋在根系表面培養1 h,取出后用鑷子輕輕地剔除濾膜表面土壤顆粒,在紫外燈(455 nm)下激發1 min后照相,照相時固定相機(Leica D-LUX 6)、濾膜與紫外燈的距離。通過預實驗和文獻[14]確定1 h的培養時間。

為了定量計算酶譜圖像的酶活性值大小,擬合了不同濃度MUB酶譜圖像的灰度值與酶活性之間的函數關系。參考上述根際土壤原位酶譜分析方法,用2 cm×2 cm的濾膜浸滿100 μL 的0、0.5、1、2、3、4、6、8、10 mmol/L 9個濃度梯度的MUB,根據濾膜吸收溶液的量及濾膜尺寸計算各個濃度濾膜上MUB的量(10-12mol/cm2)。將膜放在紫外燈下激發1 min后照相,在軟件中分析酶譜圖像。

1.4 酶譜圖像處理過程與數據分析

酶譜圖像中酶活性定量分析的方法主要根據Razavi等[14]的方法進行圖像處理。圖像分析的步驟如下,首先,在Image J中將圖像轉化為16 bit灰度圖像；然后,確定土壤背景值校正圖像,根據標準曲線將灰度值轉換為酶活性值；最后在Matlab中將酶譜圖像轉換成彩色圖像(圖1)。土壤背景值是基于酶譜圖像中非根際土壤的灰度值的平均值計算,本研究中為50×10-12mol cm-2h-1。

圖1 根盒培養、與底物結合培養、紫外光激發成像與酶活性定量過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of rhizo-box cultivation, substrate-combing incubation, Ultraviolet light excitation imaging and enzyme activity quantification

根據酶譜圖和標準曲線,計算所有像素的酶活性值,并計算所有酶譜圖像根系周圍5 mm(沿根尖向上及根伸長區向外)的酶活性數值,經統計軟件分析符合正態分布,根據酶活性正態分布曲線,將大于30%的酶活性定義為熱點區[15],在本研究中酶活性大于200×10-12mol cm-2h-1為熱點區。

根據不同酶活性熱點值下限(200×10-12mol cm-2h-1),計算3種植物沿根尖向上(記為X)和沿根伸長區向外(記為Y)兩個方向上的碳氮水解酶活性的熱點區分布范圍,即根際酶活性熱點區范圍。由此可得到3種植物根系兩個部位的碳氮水解酶的根際酶活性熱點區范圍,取碳、氮水解酶根際酶活性熱點區最大值記為Xn和Yn(n=玉米,苜蓿,莎草)。在酶譜圖像中以每種酶的Xn和Yn為半徑設置緩沖區,其中由最大(Xn,Yn)值組成的緩沖區面積為該種植物的最大根際酶活性熱點區面積,表示植物根系能夠利用土壤碳和氮的潛在根際酶活性熱點區面積。并計算碳或氮水解酶活性熱點區面積占每種植物最大根際酶活性熱點區面積的比值,表示該植物與根際微生物對土壤碳氮偏好度。公式如下：

1.5 統計分析

采用Levene檢驗和Shapiro Wilk W檢驗3種植物從根沿根尖向上及根伸長區向外兩個方向分布的酶活性,3種植物根尖、根伸長區根際酶活性熱點區范圍、根系對土壤碳氮養分偏好度符合正態分布及方差齊性。采用單因素方差分析和LSD檢驗,分析3種植物根尖、根伸長區根際酶活性熱點區范圍,同一植物不同酶根尖、根伸長區根際酶活性熱點區范圍,根系對土壤碳氮養分偏好度的顯著性分析,P<0.05為差異顯著。所有統計分析在SPSS 19.0軟件中進行,用SigmaPlot 10.0軟件作圖。數據為平均值±標準誤(n=3)。

2 結果

2.1 不同植物根際土壤酶活性的空間分布

經過30 d根盒培養后,根的半徑大小為玉米根(0.45 mm)>苜蓿(0.3 mm)>莎草(0.2 mm)(圖2)?？傮w上,βG的根際酶活性熱點區范圍是0.93—1.98 mm,NAG的根際酶活性熱點區范圍是0.59—1.86 mm(圖2和圖3)。其中,碳水解酶活性熱點區為苜蓿根伸長區(1.98 mm)>玉米在根尖和根伸長區(約為1.14 mm)>莎草根伸長區(0.93 mm)(圖4)。氮水解酶活性熱點區為莎草根尖(1.86 mm)>玉米在根尖和根伸長區(約為1.12 mm)>苜蓿根伸長區(0.59 mm)(圖4)。該結果表明苜蓿根際土壤和微生物可能對能量的需求最強烈,而莎草根際土壤和微生物可能對氮養分的需求最強烈。

圖2 不同植物根系土壤β-葡萄糖苷酶活性沿根尖向上和根伸長區向外分布Fig.2 The distribution of β-glucosidase activities from the root tip upward and the root elongation outward along different plant roots

圖3 不同植物根系土壤N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性沿根尖向上和根伸長區向外分布Fig.3 The distribution of N-acetyl glucoaminosidase activities from the root tip upward and the root elongation outward along different plant roots

圖4 三種植物根尖和根伸長區酶活性熱點區的范圍Fig.4 The rhizosphere extent of hotspot in root tip and root elongation zones for three plants大寫字母(A、B)表示同種酶在不同植物根際酶活性熱點區范圍之間的顯著性差異,小寫字母(a、b)表示同種植物不同酶之間的顯著性差異(P< 0.05 LSD檢驗);βG：β-葡萄糖苷酶β-glucosidase； NAG ：N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 N-acetyl glucoaminosidase

玉米碳氮水解酶活性熱點區在根尖與根伸長區范圍相近(1.13 mm左右)；而苜蓿在根不同部位對能量和氮養分的需求不同,體現為βG根際酶活性熱點區范圍是根伸長區(1.98 mm)>根尖(1.19 mm),NAG根際酶活性熱點區范圍為根尖(0.91 mm)>根伸長區(0.59 mm)；莎草根不同部位對能量和氮養分的需求一致為βG、NAG根際酶活性熱點區范圍均是根尖(1.38—1.86 mm)>根伸長區(0.93—1.16 mm)(圖5)。該結果表明3種植物根際土壤和微生物對能量和氮養分的需求不同,玉米對碳氮需求一致,而苜蓿根尖對氮的需求大,在根伸長區對碳的需求大；莎草則是對氮養分的需求更大(圖5)。

圖5 三種植物根際β-葡萄糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性熱點區的范圍Fig.5 The rhizosphere extent of β-glucosidase and N-acetyl glucoaminosidase activity for three plants*表示同種酶在根系不同部位根際酶活性熱點區范圍之間的顯著性差異(P< 0.05 LSD檢驗)

2.2 植物根系或根際微生物對土壤碳氮偏好

玉米根際的根系或土壤微生物對土壤碳和氮偏好度之間無差異(0.8左右)(P>0.05)(圖6)。苜蓿根際的根系或土壤微生物對碳偏好(0.85)>氮(0.34)(P<0.05)(圖6)。莎草根際的根系或土壤微生物對氮偏好(0.82)>碳(0.62)(P<0.05)(圖6)。該結果同樣表明了玉米根際的根系或土壤微生物對土壤碳、氮偏好無差異,苜蓿則偏好碳,莎草更偏好氮(圖6)。

圖6 植物根系或根際微生物對土壤碳氮偏好 Fig.6 Soil carbon and nitrogen preferences for plant root or rhizosphere microorganisms *代表同種植物β-葡萄糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷之間的顯著性差異(P< 0.05LSD檢驗)

3 討論

3.1 植物根尖和根伸長區碳氮水解酶活性的根際酶活性熱點區范圍

與假設1不同的是3種植物的碳氮水解酶最大根際酶活性熱點區范圍為是苜蓿>莎草>玉米。雖然在相同的培養條件下,玉米根系半徑(0.45 mm)最粗、且側根數量遠遠大于同樣是須根系的苜蓿和根系較少的直根系莎草,但是Frank等的研究認為玉米側根多,擴大了根系在土壤中的空間分布范圍和對土壤接觸的總面積。這不僅增加了植物根系對土壤水分和養分的吸收,而且使得玉米比其他植物根系吸水和養分的效率更高[16],因此可能降低了根系和根際微生物通過酶分解有機質獲得碳、氮養分的需求。而苜蓿和莎草根系與土壤接觸面積小,需要借助土壤酶分解有機質,間接獲取碳、氮維持自身生長,所以根際土壤酶分布范圍較廣[17]。另外,Zhang等的研究發現,當玉米與豆科植物共同種植時,玉米的根生物量和養分利用效率提高,原因就是豆科根際土壤水解酶含量多、分布廣,供給植物和微生物的有效養分含量高,促進植物生長[18]。這也說明根系作為植物生長發育所需的礦質元素的主要吸收器官,其性狀和功能都具有高度的可塑性[19]。在有效養分貧瘠的喀斯特土壤中,豆科植物根際酶活性熱點區的范圍最大,與玉米一起種植可能提高二者的養分利用效率。

與假設2一致的是莎草βG和NAG的根際酶活性熱點區范圍均是根尖>根伸長區,這是因為植物根系分泌物主要在根尖[20]。根際土壤微生物的生長和活性主要受分泌物的限制,所以根尖土壤微生物數量和代謝活性往往較高[21]。根系在穿透土壤過程中大量的細胞液和有機酸被釋放出來[22],供土壤微生物吸收的小分子礦物質元素含量豐富[23],因此根尖土壤微生物活性高,βG和NAG根際酶活性熱點區范圍在根尖>根伸長區。

與假設2部分一致的是本研究發現苜蓿NAG根際酶活性熱點區范圍為根尖>根伸長區,但是βG根際酶活性熱點區范圍卻相反,為根尖<根伸長區,這與Razavi等發現扁豆根際酶活性熱點區范圍NAG在根尖和根伸長區無顯著差異不同[5]。因為豆科植物根系的根瘤多分布在根伸長區[24],為了滿足微生物固氮所需的能量,根系和根際微生物分泌碳水解酶較多,這可能是根伸長區的βG根際酶活性熱點區分布范圍大于根尖的原因。相對地,根尖附近的土壤微生物受土壤氮養分限制[25],微生物分泌更多的NAG酶礦化有機氮,以滿足根系和根際微生物對氮養分的需求,所以根尖的NAG根際酶活性熱點區范圍較大。

與假設2不一致的是玉米βG和NAG根際酶活性熱點區在根尖和根伸長區范圍相近?？赡苁且驗橛衩讉雀l達,側根之間的分泌物相互影響降低根尖和根伸長區的空間異質性[26],所以根尖和根伸長區水解酶根際酶活性熱點區范圍差異不顯著。

3.2 植物根系或根際微生物對土壤碳氮偏好

與假設3一致的是苜蓿根際對碳的偏好大于氮,這與Razavi等發現扁豆根系對碳的需求高于對氮的需求一致[5],與土壤微生物分泌酶的經濟學原理一致,即苜蓿根系通過與根瘤菌共生來滿足對氮的需求,那么根際土壤分泌的酶則優先滿足其他限制性因素(如碳)的需求[27]。另外,莎草根際對氮的偏好大于碳,這主要受喀斯特坡耕土壤氮養分限制影響[25]。土壤有效氮含量低,莎草根系和根際微生物分泌大量氮水解酶來獲取氮養分[23]。但是研究發現玉米根際對碳氮偏好相近,主要受玉米根分泌物影響。Benizri等發現玉米根系分泌物能強烈刺激土壤微生物生長,改變微生物進化,使得根際微生物能高效利用分泌物中的養分,實現根系與微生物之間的高利用效率[28]。

4 結論

在喀斯特農田土壤中,玉米、苜蓿和莎草3種植物根系和根際土壤微生物對能量和氮養分的利用策略不同。玉米碳氮水解酶根際酶活性熱點區范圍相近且根際的碳氮養分偏好一致。莎草氮水解酶的根際酶活性熱點區范圍大于碳水解酶,根際偏好氮養分需求。而苜蓿碳水解酶的根際酶活性熱點區范圍大于氮水解酶,根際偏好碳需求。因為喀斯特退耕地土壤氮養分貧乏,退耕后種植苜蓿可以緩解氮需求,有助于喀斯特生態恢復。但是不同植物之間相互作用能否提高植物的養分利用效率、對生態環境的影響以及植物根分泌物對根際關鍵微生物和功能基因的影響尚未可知,本研究的土壤原位酶譜法為在根際尺度上微生物機制研究提供先進技術。