水稻黃葉突變體yl6（t）的遺傳分析和基因定位探究

袁鎧

摘 要 在粳稻品種日本晴群體中發現了1個黃葉自然突變體yl6（t），因此，對其進行調查研究。農藝性狀調查發現，與野生型相比，yl6（t）的結實率明顯較低;葉綠素含量測定發現，突變體yl6（t）苗期后期葉素綠含量極顯著降低，全生育期為黃葉;超微結構觀察發現，葉綠體形態改變，類囊體片層結構減少;遺傳分析表明，yl6（t）黃葉表型為單隱性核基因控制，利用SSR標記將目的基因初步定位在水稻第6號染色體約56 kb區段內，該區段未有相關基因報道，推測是1個新的控制水稻葉色的基因。

關鍵詞 水稻;黃葉突變體;遺傳分析;基因定位

水稻（Oryza sativa L.）是世界上三大糧食作物之一，中國絕大多數人口以水稻為主食。隨著人口的增加和環境的惡化，提高水稻的產量顯得十分重要。水稻產量的95%來自葉片葉綠體的光合作用，葉片是植物光合作用的主要器官。因此，研究水稻的葉色有重要的意義。

本研究對從日本晴群體中發現的自然突變的黃葉突變體進行了農藝性狀考察，對其進行遺傳分析和基因初步定位，為進一步精細定位和克隆該基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃葉突變體由粳稻日本晴經自然突變而來，暫命名為yl6（t），該突變體經多年種植發現突變性狀能穩定遺傳。其他水稻材料包括正常葉色粳稻品種日本晴和秈稻品種Kasalath。親本材料種植于揚州大學水稻試驗田，遺傳分析和定位群體種植于揚州大學農學院酒甸實驗基地，均按照常規水肥管理。

1.2 葉綠素含量測定

于苗期、分蘗期及成熟期分別測定突變體yl6（t）和野生型日本晴的葉綠素含量。各取3株的倒2葉設定生物學重復，稱取伸展完全的鮮葉（去葉脈）0.2 g。參照Lichtenthaler等的方法[1]，用分光光度計分別測定664 nm、646 nm、470 nm波長處的吸光值D，進行葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量測定。

1.3 葉綠體超微結構觀察

在水稻苗期、分蘗期分別取突變體yl6（t）與野生型日本晴的葉片，在1～3 min取樣，用刀片切成2 mm×2 mm的矩形小片，經過生物公司處理制成超薄切片，觀察突變體和野生型葉肉細胞的葉綠體形態并拍照[2]。

1.4 主要農藝性狀調查與分析

成熟期分別隨機選取兩親本各6株，統計其劍葉長、劍葉寬、有效穗數、飽粒數、總粒數、結實率、主穗長、一次枝梗數、二次枝梗數、千粒重、株高，計算平均值，進行t測驗。

1.5 遺傳分析群體和基因定位群體構建

以正常日本晴為父本與突變體yl6（t）進行雜交得到F1，自交獲得F2，以F2為遺傳分析群體。以Kasalath為父本與突變體yl6（t）雜交F1，自交獲得F2，從F2中分離黃葉表型的單株作為基因定位群體。

1.6 突變體yl6（t）的基因定位

采用BSA法，建成黃葉突變池和正常池。利用SSR標記對兩個親本突變體yl6（t）與Kasalath進行多態性分析，利用多態性良好的標記分析親本及池間的多態性，找出與目的基因可能連鎖的標記，利用隱性黃葉群體進行驗證，確定目標基因所在染色體。

根據目標基因所在的位置，設計STS標記并挑選出多態性良好的標記，利用突變體yl6（t）與Kasalath的F2群體中的1 430株黃葉突變單株進行精細定位，DNA的提取采用CTAB法。

PCR反應過程：94 ℃，5 min預變性;95 ℃，40 s變性;51～56 ℃，40 s退火;72 ℃，40 s延伸，35個循環（潮霉素30個循環）;72 ℃，10 min;16 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 突變體yl6（t）的表型特征

通過觀察種植在揚州的野生型日本晴和突變體yl6（t）可以明顯發現，與野生型日本晴相比，突變體yl6（t）在苗期后期表現為淡黃葉，生長期間不轉綠，成熟期時植株葉色已明顯黃于野生型。突變體株高較矮，分蘗較少。

突變體yl6（t）與野生型日本晴相比，農藝性狀也有所改變，具體見表1。兩者二次枝梗數、主穗長有顯著差異，株高、千粒質量達到了極顯著差異，其他農藝性狀差異不顯著。

2.2 突變體yl6（t）的葉綠素含量測定

用紫外線分光光度計分別測量了突變體yl6（t）和野生型日本晴葉片各時期的葉綠素含量。發現突變體yl6（t）苗期和分蘗期葉綠素含量均低于野生型日本晴。隨著葉片的生長，突變體葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量都極顯著下降，而胡蘿卜素含量顯著下降，這說明突變體yl6（t）葉片變黃有可能是葉綠素含量減少導致的。

2.3 突變體yl6（t）的葉綠體超微結構分析

透射電鏡觀察發現：，與野生型日本晴相比，突變體yl6（t）的葉綠體形狀不規則，內部含有嗜餓性板層小體，類囊體數量減少，說明葉綠體發育不正常。這些說明，突變體yl6（t）與野生型日本晴相比，不僅葉綠素含量有差異，葉綠體的發育情況也受到了影響，這些可能與葉色變異有關。

2.4 突變體yl6（t）的遺傳分析與基因定位

以突變體yl6（t）為母本，與正常葉色日本晴雜交，F1代自交獲得F2，在F2代中，苗期后期發生葉色的性狀分離。隨機調查500株，考察突變株和正常株數量，其中突變株數量為109株，正常株數量為391株，X2=2.56<3.84=X20.05，該結果符合孟德爾單基因分離比3∶1，證明黃葉突變體yl6（t）受一對隱性核基因控制。

利用480個SSR標記對兩個親本進行多態性分析，利用多態性較好的標記檢測混池的多態性，發現標記RM5851有明顯的多態性，位于6號染色體上，接著利用RM5851對隱性單株群體進行群體驗證，跑膠發現突變體的帶型與大部分隱性單株的帶型相同，經過計算發現這個標記與目的基因的交換率約為10%，初步確定該黃葉基因位于第6號染色體上。為了進一步定位該黃葉基因，在標記RM5851附近發展了十幾個標記，最后挑選出多態性良好的IDL標記：標記ID1279、ID1413、ID1505、ID1732。因為還有一批黃葉隱性單株群體，為了嘗試進一步縮小定位區間，于是接著利用480株黃葉突變單株進行分析，將該基因定位于標記ID1279與ID1732之間，接著繼續利用950株單株進行分析，結果發現，該基因與標記ID1437共分離，且在標記ID1432與標記ID1505分別有12個和15個交換單株，標記ID1413有18個交換單株，標記ID1610有37株交換單株，標記ID1499有13個交換單株，通過交換株個數的變化情況，表明該基因存在于標記ID1432與標記ID1499之間，物理距離約為56 kb。

3 結論與討論

本研究中所采用的材料為自然突變而來的黃葉突變體，突變方式較為安全，經過測定發現：突變體yl6（t）的農藝性狀發生了變化，葉綠素含量與野生型相比明顯降低，葉綠體產生了變異、結構發生了改變。因此該黃葉突變體葉色發生變異可能是由于葉綠素含量變化和葉綠體發育異常共同引起的。

本研究將yl6（t）基因定位到水稻6號染色體56 kb區段內，該區段中未見有關黃葉基因的有關報道，因此推測yl6（t）是一個新的黃葉基因，對該基因進一步研究將有利于闡明水稻葉色變異的分子機制。

參考文獻：

[1] Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids： Pigments of photosynthetic biomembranes[J].Methods in enzymology，1987，148C：350-382.

[2] 邱義蘭，李紅，彭克勤，等.水稻“斑馬葉”突變體B411葉綠體超微結構的觀察[J].作物學報，2010，36（1）：184-190.

（責任編輯：趙中正）