克氏原螯蝦春季爛尾病的初步研究

劉張淮，王家軍，張熒熒，朱春艷，王曉英

（寶應縣水生動物疫病與預防控制中心，江蘇 寶應 225800）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱淡水小龍蝦，屬十足目，螯蝦科，原螯蝦屬，該蝦晝伏夜出，喜歡棲息于靜水或緩流水體的水草茂盛處[1]。克氏原螯蝦廣泛分布于我國江蘇、安徽等地，現已成為我國養殖范圍最廣的淡水螯蝦養殖種類[2-3]。然而，隨著我國克氏原螯蝦人工養殖熱潮興起，相關病害的發生也越來越普遍，國內外有許多關于克氏原螯蝦病原的報道，主要病原有嗜水氣單胞菌[4]、螺原體[5]和白斑綜合征病毒[6-8]等。

2020年4月，江蘇寶應一家龍蝦養殖場發生克氏原螯蝦爛尾病，患病蝦可以正常攝食，除尾扇部分潰爛外，體表無明顯病變。為防止病害的繼續發展，作者立即組織相關人員采集病蝦樣本，帶回實驗室作進一步研究。

1 材料和方法

1.1 樣品

患病蝦采集于揚州市寶應縣某龍蝦養殖場，平均體質量20 g左右，體長10 cm左右。

1.2 試劑與儀器

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基；革蘭氏染色試劑盒；動物用藥敏分析試劑板；Protease K、2K DNA Marker、ddH2O 和 2×EasyTay PCR SuperMix；DNA提取試劑盒。

BX53光學顯微鏡、SHP-160型生化培養箱、THZ-82B型空氣搖床、潔凈工作臺、細菌自動鑒定系統；干式恒溫器、MIKRO200R型臺式高速冷凍離心機、S1000型PCR儀、BG-Power 600型電泳儀、INFINITY-3026型凝膠成像系統。

1.3 細菌分離

用無菌接種針蘸取病蝦尾部病灶部位于營養瓊脂平板上劃線，于30℃培養箱過夜培養，進行3次分離純化，得到兩株優勢菌。同時，將分離出的菌落接種于營養肉湯培養基，于30℃空氣搖床中過夜培養，保存菌液。

1.4 形態觀察和細菌初步鑒定

觀察培養基平板上菌落形態，對分離出的兩株優勢菌進行革蘭氏染色，于1 000倍光學顯微鏡下觀察，比較菌株形態差異。使用細菌自動鑒定系統對分離出的兩株細菌進行初步鑒定。

1.5 DNA提取

收集菌液，12 000 r/min離心2 mins，棄去上清，然后按照DNA提取試劑盒操作說明提取細菌DNA。

1.6 16S rRNA基因測序和分析

使用16S rRNA通用引物F（5’-AAACTCAAAG GAATTGACGG-3’）和 R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’）對提取出的細菌DNA進行PCR擴增，參考彭宣憲等人方法[9]。PCR反應體系25 μL：模板1 μL，正反向引物各 1 μL，SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循環；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴增產物一部分進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，另一部分送往上海生工生物股份有限公司進行16S rRNA基因測序。

1.7 藥敏試驗

使用動物用藥敏分析試劑板檢測兩種細菌對8種常見抗生素的藥物敏感性，藥敏結果判定參照《抗微生物敏感試驗的執行標準》（CLSI）[10]。

2 結果

2.1 細菌分離

從患爛尾病克氏原螯蝦尾部病灶分離出兩株細菌，分別編號為S1和S2。

2.2 形態學觀察

如圖1所示，菌株S1菌落為圓形，淡黃色，直徑約為1~2 mm；S2菌落為圓形，灰白色，直徑約為1~2 mm。S1和S2均為革蘭氏陰性，短桿狀。

圖1 菌株S1和S2的形態特征

2.3 細菌初步鑒定結果

將S1和S2兩種菌株接種到生化反應板中，30℃培養24 h后，使用細菌自動鑒定系統進行初步鑒定。結果如表1所示，通過相關理化反應，S1初步鑒定為嗜水氣單胞菌，S2為弗氏檸檬酸桿菌。

2.4 16S rRNA基因測序結果

如圖2所示，菌株基因片段大小為520 bp左右，與理論值一致。同時將16S rRNA基因序列提交BLAST進行比對，與部分模式菌株比對結果如表2所示，菌株S1與嗜水氣單胞菌相似性為99.36%，S2與弗氏檸檬酸桿菌相似性為100%，綜合上述結果，可確定菌株S1為嗜水氣單胞菌，菌株S2為弗氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株S1和S2的初步鑒定

圖2 16S rRNA基因序列擴增結果

2.5 藥敏試驗

如表3所示，藥敏試驗結果表明兩種菌株均對恩諾沙星和硫酸新霉素高度敏感，對磺胺類藥物均不敏感。此外，S1對甲砜霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環素高度敏感；S2對氟苯尼考和鹽酸多西環素中度敏感。

表2 菌株S1和S2的16S rRNA基因序列比對相似性

表3 菌株S1和S2的藥敏特性

3 討論

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為弧菌科氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，可以引起多種淡水養殖魚類感染，包括草魚、鰱、鳙、鯽、鳊、鯉等。由嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血癥已成我國水產養殖業危害淡水魚種類最多、分布地域最廣、流行季節最長、造成損失最大的一種急性傳染病[3，11]。隨著近幾年甲殼動物，如蝦、蟹人工養殖的增多，甲殼動物感染嗜水氣單胞菌引起大批死亡的報道也越來越多，如2010年，浙江安吉克氏原螯蝦養殖死亡嚴重，經細菌分離鑒定，病原菌為嗜水氣單胞菌[4]；2010年，嗜水氣單胞菌引起汕頭市牛田洋水產養殖區鋸緣青蟹患病死亡[12]。

弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）為腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，常見于糞便和尿液中，可以作為一種糞便污染的微生物學指標[13]。弗氏檸檬酸桿菌作為人類腸道中的正常菌群，是一種兼性厭氧的條件致病菌，最早報道與人的腹瀉有關[14]。近年來，在魚類和蝦蟹類養殖上也有報道，如2016年，柳州市柳城縣一家養殖場羅非魚大量死亡，經鑒定后確定病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[15]；2012年，弗氏檸檬酸桿菌引起安徽省全椒縣兩家克氏原螯蝦稻田養殖場爆發性死亡[16]。

嗜水氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌都是水產動物病害的常見病原，廣泛存在于自然水體中。本實驗對春季克氏原螯蝦爛尾病進行了基礎性探索，具體關于克氏原螯蝦爛尾病的病原菌判定還需要后續的深入研究。

4 結論

目前，作者從克氏原螯蝦爛尾病灶處分離出嗜水氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌兩種細菌，在養殖生產中可以使用恩諾沙星和硫酸新霉素對其進行防治。