不同生長期蘄春艾葉總黃酮和綠原酸含量變化

曾心怡

長江大學 醫學部，湖北 荊州 434023

艾葉系菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥葉，又名灸草，為多年生草本植物，其味辛、苦，性溫，入肝、脾、腎經，具有溫經止血、散寒止痛之功效，臨床用于吐血、衄血、崩漏等癥[1]。全國各地所產艾葉中以明代李時珍故居湖北蘄春所產為佳，當地謂之為“蘄艾”，被視為艾中珍品、道地藥材[2]。當前，對蘄春艾葉的研究與應用主要圍繞其揮發油的提取[3-6]、藥理活性[7-9]及臨床應用[10-13]研究，鮮有其總黃酮、有機酸、多糖等成分及其綜合開發應用研究的報道。蘄春艾葉作為蘄春當地的特色地理標志產品[14]，其開發利用仍集中于揮發性成分，揮發性成分粗加工產品以艾條、艾絨、揮發油等系列產品為主[15]，然而蘄春艾葉的采收期(端午節前后)過后，隨著揮發性成分含量急劇下降其藥用價值難以持續體現，加之粗加工提取揮發油后藥液和藥渣含有大量的總黃酮和有機酸成分[16]，大量遺棄勢必造成蘄春艾葉資源的浪費，故測定不同生長期蘄春艾葉總黃酮和綠原酸對于開發高附加值產品有積極的促進意義。基于此本研究針對不同生長期蘄春艾葉的總黃酮、綠原酸進行分析和比較，為進一步綜合開發和利用提供參考依據。

1 材料

Waters2695型高效液相色譜儀;Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；CP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；UV-8000紫外-可見分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；KQ-250E超聲波發生器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；98-1-B電子調溫加熱套(天津泰斯特儀器有限公司)。

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110722-201511，純度>99.90%)；綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201513，純度>99.99%)；乙腈(美國天地公司，色譜純)；其余試劑均為分析純；水為三蒸水。

艾葉分別于2015年5、6、9、10月采自湖北蘄春(樣品編號分別為150515-S1、150518-S2、150616-S3、150630-S4、150916-S5、150927-S6、151001-S7、151007-S8)。樣本經湖北中醫藥大學中藥資源開發教研室方念伯教授鑒定為菊科植物艾ArtemisiaargyiLévl.et Vant.的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 不同生長期艾葉藥材中總黃酮含量測定

2.1.1溶液配制

2.1.1.1對照品溶液 取蘆丁對照品適量，經120 ℃充分干燥，放冷后精密稱定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇置于水浴中微熱使溶解，定容并搖勻制成5.0 mg·mL-1的溶液作為蘆丁對照品儲備液。精密量取蘆丁儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.1.2供試品溶液 分別取各批次艾葉藥材約1.00 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHZ)30 min，放冷，再稱定質量，用60%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2線性關系考察 精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，最后加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，照《中華人民共和國藥典》紫外-可見分光光度法，分別于508 nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制工作曲線。得線性回歸方程為：Y=0.011 7X-0.007，r=0.999 7。結果表明，蘆丁于20.0～100.0 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.1.3方法學考察 精密度試驗：精密吸取對照品溶液3.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2項下自“加水至6 mL”起操作，在同一條件下分別測定吸光度6次，吸光度的RSD為0.13%，結果表明，儀器的精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液2.0 mL，置25 mL量瓶中，按2.1.2項下自“加水至6 mL”起操作，分別在0、10、20、40、60 min后測定吸光度，RSD為0.14%，結果表明，供試品溶液穩定性良好。

重復性試驗：取供試品6份，每份1.0 g，精密稱定，照2.1.1.2項下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，按2.1.2項下自“加水至6 mL”起操作，在同一條件下分別測定吸光度，將吸光度值代入回歸方程中計算總黃酮含量，結果總黃酮含量RSD為1.89%。

2.1.4加樣回收率試驗 取已知含量的同一批供試品(批號：150515-S1)6份，每份100 mg，精密稱定，分別加入一定量的蘆丁對照品，照2.1.1.2項下的方法依法制備，精密吸取各供試品溶液2.0 mL，置5個25 mL量瓶中，按2.1.2項下自“加水至6 mL”起操作，依法測定，結果見表1。結果表明，該方法加樣回收率良好。

表1 艾葉中蘆丁加樣回收試率驗結果(n=6)

2.1.5測定法 精密吸取供試品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至6 mL，照2.1.2項下的方法，自“加5%亞硝酸鈉溶液1 mL”起，依法測定吸光度，同時取供試品溶液1 mL，除不加蘆丁對照品溶液外，其余同上操作作為空白，根據標準曲線計算出供試品溶液中含蘆丁的質量，即得。

隨著肥胖婦女的不斷增多，肥胖孕婦的比例也在不斷增加，孕前體質量及孕期增重對妊娠結局的影響受到越來越多的關注。有研究[7-8]表明，過高、過低的孕前BMI水平及妊娠體質量增長會導致新生兒體質量異常。所以，孕期應有效控制肥胖孕婦體質量增長。

2.1.6結果 按上述測定方法，對不同生長期蘄春艾葉藥材中總黃酮含量進行測定，結果見表2。

表2 不同采收期艾葉總黃酮的含量測定結果 mg·g-1

2.2 不同生長期艾葉藥材中綠原酸含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈為(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～13 min，10%～20%A；13～20 min，20%～45%A；20～25 min，45%～10%A)，柱溫：30 ℃，檢測波長：326 nm，流速：0.8 mL·min-1；進樣量10 μL。理論塔板數以綠原酸色譜峰計不低于4000。

2.2.2溶液配制

2.2.2.1對照品溶液 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.06 mg的溶液，即得。

2.2.2.2供試品溶液 參照文獻[16]，取艾葉藥材適量、剪碎，精密稱取2 g置于具塞錐形瓶中，精密加50%的甲醇溶液50 mL，密塞稱定其質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)2 h，取出放冷至室溫，用50%甲醇溶液補足減失的質量，濾過，移取濾液10 mL于25 ml容量瓶中，以50%甲醇溶液定容，搖勻，微孔濾膜濾過即得供試品。

2.2.3系統適用性試驗 各取上述供試品、對照品和空白溶劑，分別按照2.2.1項下進行分析，結果見圖1。由圖1可知，該分析條件下綠原酸與相鄰的峰分離度良好，且樣品中其他組分對綠原酸的分離無干擾。

注：A.艾葉供試品；B.綠原酸對照品；C.空白溶液。圖1 綠原酸對照品和艾葉HPLC圖

2.2.4線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、10、12、15 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣，測定峰面積。以綠原酸對照品的進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程：Y= 27.274X+0.348，r= 0.999 7。結果表明：綠原酸在0.12～0.90 μg進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

穩定性試驗：取供試品溶液(批號：20150515)按上述色譜條件，分別在0、4、8、12、24 h記錄其峰面積，峰面積 RSD為0.57%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批供試樣品6份，每份約2 g，精密稱定，按2.2.2.2項下制備供試品溶液，分別進樣10 μL進行測定，計算綠原酸含量，RSD為1.18%，表明重復性良好。

2.2.6加樣回收率試驗 取已知含量的同一批艾葉6份，每份2 g，精密稱定，加入一定量的綠原酸對照品，按2.2.2.2項下制備供試品溶液進行測定，計算加樣回收率結果見表3。

表3 艾葉中綠原酸加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3 樣品測定結果

取各批次的艾葉藥材按2.2.2.2項下供試品溶液的制備依法制備各供試品，按上述測定方法，對不同生長期蘄春艾葉綠原酸含量進行測定，結果見表4。

表4 不同采收期艾葉中綠原酸含量測定結果 mg·g-1

3 討論

3.1 艾葉藥材中總黃酮含量測定

研究中曾參考文獻[16]以柚皮苷作為對照品，不加顯色劑于283 nm波長處測定吸光度，結果發現，對照品柚皮苷顯色后呈淡黃色，而制備的供試品溶液顏色較深，測定存在一定程度的背景干擾，空白試劑無法有效消除樣品的背景干擾；而研究發現采用亞硝酸鈉顯色法能夠較好地消除背景干擾，故最終采用亞硝酸鈉顯色法測定其總黃酮含量。結果表明，5月、6月和9月艾葉中總黃酮含量差異無統計學意義。9月末隨著艾葉植株逐漸老化，總黃酮呈現急劇下降趨勢，10月后艾葉藥材總黃酮質量分數下降至1.36 mg·g-1，含量較9月末前下降了約80%。這一研究結果提示，在艾葉藥材的次生代謝產物中，總黃酮對季節的變化敏感度相對較低，僅在10月艾葉植株老化之后，艾葉營養分散，次生代謝產物合成速率減慢，總黃酮含量急劇減少。

3.2 艾葉藥材中綠原酸含量測定

研究最初采用文獻[16]的梯度洗脫程序對綠原酸含量進行測定，發現洗脫時間較長，長達60 min，不能較好地滿足含量測定的時限要求，在此基礎上進行優化并縮短梯度洗脫時間，保證綠原酸分離度達到要求，建立的方法更加快捷、迅速。結果表明，5月、6月和9月艾葉中綠原酸含量差異無統計學意義。不同生長期艾葉中綠原酸的含量由高到低依次為：6月、9月、5月、10月。6月艾葉中綠原酸含量較高，10月艾葉綠原酸含量較低，10月份綠原酸含量較9月份前降低了約78%。傳統認為艾葉采收期夏季未開花時(端午前后)，此時揮發性成分含量最高，綠原酸的含量也呈現出最高水平。盡管已有大量研究報道指出艾葉熏洗液有較強的抑菌效果，但其抑菌效果是否源自于艾葉揮發性成分和其中的總黃酮、綠原酸類成分的共同作用還值得進一步考證。

4 結論

從不同生長期艾葉總黃酮和綠原酸的分析結果可知：全年中5月、6月和9月時艾葉中總黃酮含量和綠原酸含量總體上變化程度不大，總黃酮和綠原酸對季節變化的敏感程度較低且兩者含量變化呈一定程度的正相關，即總黃酮含量降低時綠原酸含量也隨之降低。《中華人民共和國藥典》中對艾葉的采收期規定為夏季未開花時(端午前后)采收，而此時艾葉的揮發性成分藥用價值難以體現，是為艾葉藥用資源的浪費。本研究結果為采收期后至10月前這段時期蘄春艾葉的綜合利用與合理開發提供參考依據。