大蠟螟卵粒快速計數法

張俊俊 王桂珍 尹志龍 劉平臻 汪正威 │文

1 中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態學重點實驗室，昆明650223；2 中國科學院大學，北京100049；3 云南普洱學院生物與化學學院

大蠟螟（Galleria mellonellaL.）是蜜蜂重要的害蟲，其幼蟲寄生于蜂巢內，喜上脾吞食蜂巢，善鉆蛀隧，損壞蜂巢，又被稱為“巢蟲”[1]。大蠟螟危害嚴重時，中蜂群內會產生大量“白頭蛹”，導致子脾不能正常羽化[2]，當無法得到控制時便會棄巢飛逃，其幼蟲會破壞蜂群內所有空巢脾。而大蠟螟對意蜂的危害則主要表現在侵染弱群，破壞蜜粉脾，給蜂農造成不可估量的經濟損失。

圖1 大蠟螟生活史（a 卵，b 幼蟲，c 蛹，d 成蟲）

大蠟螟為完全變態昆蟲，生長周期分四個階段：卵、幼蟲、蛹、成蟲[1]（圖1）。自然條件下，發育期長短隨季節變化而略有差異。據報道，大蠟螟卵期8～23天，初產卵呈短橢圓形，卵殼較硬且厚，隨孵化時間增加逐漸由乳白色變為黃褐色，表面開始布有網狀刻紋，其卵塊一般為單層，卵粒緊密排列。大蠟螟幼蟲共8齡[1]，每齡期4～7天，因外界溫度和食料不同而略有差異，2～3齡幼蟲外形會發生很大變化，成熟幼蟲體長12～28mm，重量可達240mg；老熟幼蟲吐絲結繭化蛹，繭為白色絲織物，厚密結實，兩端絲織疏松，呈長橢圓形。蛹期6～55天，蛹呈紡錘形，化蛹初期為淡黃色，羽化前呈褐色或黑色。雌蛾個體較雄蛾大，在自然條件下，雌蛾歷期7～9天，體長18～22mm，重達123±2mg，羽化后1～3小時開始交尾，交尾4～5小時后產卵，平均產卵量725±149粒，雄蛾歷期1 2～2 4 天，體長14～16mm，重74.0±7mg[1-2,4]。大蠟螟成蟲口器退化，在成蟲期不取食，危害較大的是幼蟲期（巢蟲），其幼蟲會取食蜂群巢脾，1～2齡幼蟲會蛀食巢脾，并在巢脾上吐絲作繭，嚴重損壞巢脾結構、蛀蝕蜂具[3]。蠟螟幼蟲除破壞巢脾外，還會危及蜂群中的封蓋子脾。除此之外，3～4齡幼蟲會造成蜂群蛹和幼蟲大量死亡，使得蜜蜂群勢潰敗。

大蠟螟是全球范圍內普遍存在的蜜蜂害蟲，不僅危害蜂群，還威脅蜂產品產量和質量[5]。一對雌雄大蠟螟日產卵量在100～900粒以上，最高可達2000粒，300頭蛹日出蟲率可達67%以上，并在2天內完成交配，可見蠟螟產卵量之多，出蟲率之快，交配率之高，繁殖速率之快，產生的危害之大。但是尚未有能夠有效、快速檢測蠟螟蟲卵數量的方法。本文介紹三種能夠在實驗室內快速檢測大蠟螟蟲卵數量的方法，以期找到優化、便捷的蟲卵計數法，用于對大蠟螟種群數量變化的動態監測。

一、大蠟螟實驗室養殖條件

1.大蠟螟來源

圖2 A 直接計數法，B Motic 面積計數法，C PS 像素計數法

采集受大蠟螟侵染的蜂群，實驗室人工培養3代后用于試驗，培養箱條件為溫度27℃～32℃，相對濕度65%～75%。

2.飼料配方

采用黃誠華等[6]研發的優化配方，即每份飼料添加酵母粉5.40g、甘油24.00g、奶粉10.20g、蜂蜜11.76g、蜂蠟16.68g、面粉51.96g。

3.卵塊收集

大蠟螟幼蟲分批次飼養，每一批次飼養200～400頭，再分別用飼養盒分裝大幼蟲，每盒50～60頭。根據大蠟螟雌雄蛹的體型差異判斷，在蛹期將大蠟螟按雌雄分開養殖。待蛹羽化后，隨機選擇雌雄成蟲交配產卵，收集當天產下的卵塊進行試驗。

二、卵塊計數方法

首先，隨機挑選產卵后的紙片，選出三個卵粒范圍的紙片各10張（下稱卵片），卵粒范圍設置：≤100粒，100～200粒，≥300粒，并給每張卵片依次編號，以供試驗使用。分別用人工直接計數法、Motic Images plus 2.0 ML軟件面積計數法（簡稱Motic面積計數法）、Adobe Photoshop軟件像素計數法（簡稱PS像素計數法）計算卵粒數量，并記錄每種方法在不同卵粒范圍計數時所消耗的時間（圖2）。

1.人工直接計數法

選擇干凈帶卵的紙張，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，人工計數，記錄每張卵片的蟲卵數量。

2.Motic面積計數法

選擇干凈的卵片，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，將Motic Images plus 2.0 ML軟件與體式顯微鏡連接，使用該軟件對每一張卵片進行圖片采集，并對每張圖片編號保存。隨即將圖片導回到軟件中進行處理，步驟如下：（1）選擇測量工具；（2）再選擇不規則多邊形框選工具，手動對每個圖片中蟲卵區域進行描邊，軟件會自動計算出所選擇區域面積；（3）最后用該方法隨機框選出5顆卵粒面積，并求單粒面積平均值，通過計算可得出：總卵粒數（粒）=總卵粒區域面積/單粒面積平均值。

3.PS像素計數法

選擇干凈的卵片，按照編號順序依次在體式顯微鏡下觀察，將Motic Images plus 2.0 ML軟件與體式顯微鏡連接，使用該軟件對每一張卵片進行圖片采集，并對每張圖片編號保存。隨后將圖片導入到Adobe Photoshop CC 2017軟件中使用像素框選計數卵數，步驟如下：（1）選擇像素框選工具中的魔棒工具對照片中蟲卵區域自動進行框選，容差調為0；（2）再用矩形選框工具，或者橢圓選框工具，手動微調多選和漏選的區域，以減小誤差：（3）選框完成后，選擇直方圖，記錄軟件直接計算出的像素大小；（4）再用套索工具，隨即隨機選擇5顆卵粒，同樣選擇直方圖，計算其像素平均值，通過計算可得出：總卵粒數（粒）=總蟲卵區域像素值/單粒像素平均值。

三、結果與討論

1.三種方法對三種卵粒范圍的卵粒數量

研究結果：三種計數方法分別對同一卵塊范圍計數，在卵塊范圍≤100粒時，卵粒數量依次為：直接計數法為61±6.307粒（Mean±SE，下同），Motic面積計數法為65±6.943粒，PS像素計數法為63±5.681粒；在卵塊范圍在100～200粒時，直接計數法為163±17.704粒，Motic面積計數法為160±15.467粒，PS像素計數法為168±16.700粒；在卵塊范圍≥300粒時，直接計數法為451±44.708粒，Motic面積計數法為422±35.331粒，PS像素計數法為453±51.636粒。通過對卵粒數量進行單因素方差分析，結果表明：同一卵塊范圍，不同計數方法的卵粒數量之間的差異均不顯著（P＞0.05）；而同一計數方法，不同卵塊范圍的卵粒數量之間的差異達到極顯著水平（P＜0.01）（圖3）。

圖3 三種方法計數三種卵塊范圍的卵粒數量

2.討論

本研究結果說明，Motic面積計數法和PS像素計數法，同樣適用于蠟螟蟲卵卵粒的計數，無論是較低的卵塊范圍，還是較高的卵塊范圍，兩種方法均表現出較強的可信度，與人工直接計數法計算的卵粒數差異較小，這兩種卵粒計數法均適用于大蠟螟蟲卵的計數。當單次產卵總卵粒數小于100粒時，使用人工直接計數法觀察計數較此兩種方法更節省時間，且具有計數更準確的優點，出現的誤差比自動計數法更小。但是，當卵粒數大于100粒以上，隨著卵粒數量的增加，三種方法比較可知：人工直接計數法耗時最長，PS像素計數法次之，Motic面積計數法最節省時間。

大蠟螟對蜜蜂的危害，不僅表現在影響蜂群的發展壯大，還會影響其產蜜量及蜂蠟等蜂產品的品質。大蠟螟快速的卵數計數方法，不僅可以幫助我們實時監測大蠟螟的發生、發展規律，更有助于我們快速對其繁殖期蟲卵數量進行動態監控，做好蠟螟蟲情發生與預測工作，并對大蠟螟防治提供支撐。為了保護傳粉昆蟲，維持養蜂業的平穩發展，使得蜂農經濟效益最大化，對大蠟螟的相關研究刻不容緩。