益生菌對潰瘍性結腸炎影響的研究進展

史佳鷺,閆芬芬,李慧臻,焦雯姝,關嘉琦,宋 月,霍貴成

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎性腸病,臨床主要表現為腹痛、腹瀉、血便等,嚴重影響患者生活質量,甚至會演變為癌癥,與克羅恩病（Crohn's disease,CD）都屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）[1]。流行病學統計,美國和西歐國家等UC的發病率較高[2],近年來我國UC患病人數也逐年增多且患病人群呈現年輕化趨勢[3]。目前其病因和發病機制尚且不明,可能與遺傳、免疫、營養、細菌、病毒及其他環境因素有關。研究發現,人體腸道菌群在UC發病機制中起著重要的作用,且可能決定腸道炎癥的嚴重程度。腸道菌群失調,黏膜屏障功能消失,使腸道致病菌侵襲黏膜下層,微生物抗原激活,導致宿主免疫失調,炎癥細胞活化使機體發生炎癥反應,因此對腸道菌群的干預成為一個有潛力的治療措施[4]。益生菌是一類攝入適當數量時會對宿主健康產生有益作用的活性微生物的總稱,在UC患者的臨床治療中,其可恢復患者腸道菌群平衡,抑制炎癥反應,且副作用較傳統藥物治療小[5-7]。本文介紹了腸道菌群在UC發病機制中的作用,以及益生菌在治療UC方面的研究進展。

1 腸道菌群與潰瘍性結腸炎

1.1 腸道菌群

人體微生物群包括細菌、真菌、噬菌體和病毒,其充當“器官”與宿主相互協同作用,構成穩定的生態系統。其能夠在皮膚、泌尿生殖系統、呼吸系統中和腸道中定植,尤其是腸道內含有超過人體細胞數目10 倍的微生物,其所含的基因更是超過人體自身基因的150 倍[8]。腸道菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門,根據需氧情況,分為專性厭氧菌、兼性厭氧菌和好氧菌。這些腸道菌主要分布在結腸和遠端小腸,定植在腸黏膜表面,形成“菌膜屏障”,在腸道營養物質代謝、腸道通透性和腸道免疫等方面發揮重要的作用[9]。腸道穩態時結腸細胞代謝趨于氧化磷酸化和脂肪酸氧化,耗氧量高,因此形成的低氧環境利于專性厭氧菌生長,它們可降解纖維生成短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFA）,進而促進宿主健康。腸道病原體會破壞結腸細胞代謝,導致腸上皮氧合作用增加,會導致以兼性厭氧菌增殖為特征的菌群失調[10]。根據腸道微生物在宿主中的作用,可將其分為3 類：共生菌是腸道的主要微生物群（如雙歧桿菌、擬桿菌和鏈球菌）,附著在黏膜上皮細胞上,在營養和免疫調節中起關鍵作用；條件致病菌是腸道非優勢細菌（如腸球菌和腸桿菌）,在機體條件成熟時能夠對機體產生致病作用；病原菌（如變形桿菌和假單胞菌）在人體腸道多為過路菌,長期定植機會少,一般不致病,但當病原菌大量繁殖時,則會引起疾病的發生。人體腸道群菌在正常狀態下呈現動態平衡,當平衡遭到破壞,腸道微生態失調,黏膜屏障破壞,病原菌入侵,激活體內免疫系統,細胞因子釋放失衡,活化炎癥細胞導致腸黏膜發生炎癥反應,誘導結腸炎發生[11]。

1.2 潰瘍性結腸炎的腸道內菌群變化

早期腸道內大多數細菌無法用常規技術培養,但隨著培養組學的發展,如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜以及16S RNA測序用來鑒定細菌物種,迅速提高了人們對腸道微生態的認識。越來越多的證據證明腸道菌群在UC發病機制中起重要作用,且可能決定腸道炎癥的嚴重程度[12-13]。與健康者相比,UC患者腸道內微生物變化主要體現為兼性厭氧菌（如柔嫩梭菌群、梭菌屬IV簇）減少,且條件致病微生物的增加,如克雷伯氏菌、腸桿菌、變形桿菌和真菌；乳桿菌和雙歧桿菌顯著減少,擬桿菌數量增加（表1）[14]。此外發現在UC患者中,炎癥最嚴重的部位是腸道細菌最多的結腸區域,且無菌小鼠不會發生嚴重的結腸炎,這提示UC的發病機制可能與腸道微生物有重要關系。

表1 UC患者腸道菌群變化Table 1 Changes in intestinal flora in patients with UC

1.3 腸道菌群在UC發病中的作用機制

1.3.1 影響短鏈脂肪酸

在結腸區域腸道共生菌酵解膳食纖維生成短鏈脂肪酸,研究認為腸道內SCFA數量的減少與UC的發病密切相關。丁酸鹽作為一種重要的短鏈脂肪酸鹽,不僅是結腸上皮細胞重要的能量來源,能夠促進腸腔內鈉、鉀和水的吸收,還可以抑制炎癥因子釋放,通過增加黏液素和抗菌肽產生,上調緊密連接蛋白的表達來增強上皮屏障完整性,對結腸健康具有重要作用。研究發現,UC患者腸道菌群在炎癥活躍的區域產丁酸鹽的細菌數量降低,如F.prausnitzii和人羅斯拜瑞氏菌（Roseburia hominis）。處于活動期的UC患者糞便中丁酸鹽的濃度降低,腸黏膜氧化丁酸鹽的能力也下降,但緩解期UC患者體內丁酸鹽氧化處于正常水平。Nancey等發現UC患者丁酸鹽氧化降低可能與結腸發炎處腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平增加有關[21]。另一方面,在UC患者中發現含有較高水平的硫酸鹽還原菌（sulfatereducing bacteria,SRB）和較高濃度的硫化氫,而在體外實驗證明硫化氫抑制丁酸鹽氧化[22-23]。提示丁酸鹽作為細菌代謝產物,保護腸道黏膜屏障,抑制腸道炎癥,參與結腸炎的發展。

1.3.2 參與免疫調節

圖1 NF-κB/IκB通路[26-27]Fig.1 NF-κB/IκB signaling pathway[26-27]

腸道微生物通過提供抗原或其他刺激因子,對炎癥反應中啟動或維持腸道免疫起重要作用,這與UC發生密切相關。許多研究證實核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路參與多種免疫異常相關疾病,如炎性腸病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等[24]。在UC患者中腸道菌群失衡,黏膜屏障功能和通透性改變,革蘭氏陰性菌發生易位,進入淋巴和血液系統。革蘭氏陰性菌的內毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激先天性免疫系統,與Toll樣受體4（Toll-like receptors 4,TLR4）結合,從而活化髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）依賴途徑,MyD88依賴途徑通過細胞內信號分子募集并活化下游的腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）,活化的TRAF6進一步激活NF-κB信號通路。在穩定狀態時NF-κB在細胞質中與它的抑制子IκB結合,當細胞受到刺激后,復合物IκB蛋白發生磷酸化和泛素化,NF-κB單體從復合物中釋放出來并進入細胞核,隨后NF-κB單體將有序的調控下游基因的轉錄和翻譯過程,促使機體產生大量的炎性因子,如TNF-α、白介素（interleukin,IL）-6、IL-1β等（圖1）,從而增加共刺激分子在抗原提呈細胞表面的表達,進而激活T細胞激活免疫系統致炎癥反應發生。表明腸道菌群不僅對天然免疫有調控作用,而且也對適應性免疫有重要作用。目前,一項納入17 名健康者和15 名炎癥性腸病患者糞便樣本的研究中,對無菌小鼠進行糞菌移植,結果發現在受體小鼠中,IBD患者糞便菌群可誘導更多的輔助性T細胞（helper T cell,Th）2和Th17,而健康者糞便菌群能誘導更多的RORγt+調節性T細胞（regulatory T cells,Treg）。在結腸炎易感小鼠模型中,移植IBD患者菌群與移植健康者菌群相比,小鼠更容易患病[25]。揭示腸道菌群通過誘導T細胞向不同細胞亞群分化,從而影響不同細胞因子分泌,介導結腸炎發生。

1.3.3 與膽汁酸相互作用

膽汁酸是膽固醇的代謝產物,在小腸中腸道微生物通過膽鹽水解酶（bile salt hydrolases,BSH）對結合膽汁酸進行早期解離,再對其進行7-脫羥基反應生成次級膽汁酸[28]。次級膽汁酸是人糞便中膽汁酸的主要成分,適當濃度的次級膽汁具有免疫調節能力。胃腸道中BSH活性主要來自厚壁菌門（30%）、擬桿菌門（14.4%）和放線菌門（8.9%）,提示UC患者腸道內擬桿菌門和厚壁菌門數量的變化可能是導致膽汁酸代謝改變的基礎原因[29]。宏基因組分析UC患者關于膽汁酸代謝的細菌基因豐度,結果發現BSH基因豐度下降。同時,IBD患者體內對膽汁酸解耦合、脫羥基和脫硫活性下降[30]。因此,UC患者血清和糞便中次級膽汁酸含量降低,而結合膽汁酸在糞便中增加,減弱對法尼醇X受體（farnesoid X receptor,FXR）和G蛋白偶聯膽汁酸受體5（G protein coupled bile acid receptor 5,TGR5）的刺激,失去維持黏膜屏障的完整性與抗炎作用,這有助于UC發病機制。此外,通過研究FXR（NR1H4）基因中的5 個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）,發現其中的SNP rs3863377顯示與UC發病呈負相關,說明FXR（NR1H4）基因編碼的遺傳變異與IBD有關[31]。目前還不清楚SNP的缺失或增加是否會影響FXR的功能,但UC患者攜帶SNP rs386377基因顯著低于健康者,提示SNP rs386377對該病具有保護作用。

1.3.4 與宿主基因相互作用

腸道微生物菌群的豐度在一定程度上受宿主基因型的影響,這種特定的遺傳變異和特定細菌的豐富之間的關系成為被稱為微生物群數量性狀基因座[32]。雙胞胎研究表明,產生丁酸鹽及使醋酸鹽-丁酸鹽轉化的瘤胃球菌,在一定程度上可以遺傳[33]。在動物實驗中也發現某些微生物屬與基因位點有關,如消化道細菌Akkermansia與2和7號染色體上的基因座相關聯[34]。有研究發現,雙胞胎腸道微生物具有相似性,進一步表明了宿主基因可以影響腸道菌群[35]。此外,初步研究數據顯示,IBD患者中腸桿菌科的豐度變化與NOD2基因變異有關。在一項研究中,收集313 位IBD患者（包括188 位CD患者、107 位UC患者、18 位中級和未明確的IBD患者）與582 位健康者的糞便、外周血和臨床數據。采用16S rRNA測序分析腸道菌群組成,利用基因上11 個與IBD有關的遺傳變異位點衡量遺傳風險,包括與細菌有關的NOD2、CARD9、ATG16L1、IRGM和FUT2基因。結果發現在具有高度遺傳風險的健康人中,遺傳風險值與羅斯氏菌屬豐度下降顯著相關[36],揭示了與IBD相關的遺傳變異可影響正常人的腸道菌群。

目前針對防治UC的傳統藥物主要為氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑和抗體制劑等[37-40],但因傳統藥物治療存在效果不佳、副作用大和依賴性強等局限性,治療UC的新型方法的研究成為熱點,而益生菌具有調節腸道菌群平衡,抑制炎癥反應的特性,近年來其在UC的治療中取得一定療效。

2 益生菌與潰瘍性結腸炎

2.1 益生菌對潰瘍性結腸炎的影響

世界衛生組織將益生菌定義為“一類活的微生物,當有足夠量的活菌體到達宿主腸道、定植從而改變宿主腸道菌落平衡,進而對宿主起著健康效應”[41]。UC是一種反復發作的慢性疾病,分為活動期和緩解期,盡管經過誘導緩解治療后,臨床癥狀與病理學可以獲得最大程度的改善,但仍可出現反復,因此如何誘導緩解以及長期維持緩解是治療UC的關鍵[42]。目前大量研究表明,益生菌制劑可以不同程度緩解UC的嚴重情況（表2）,乳酸菌、雙歧桿菌和腸球菌是常用的益生菌。益生菌中可以恢復受損的黏膜屏障功能,調節腸道微生物群失衡,抑制病原菌,增強腸道及系統免疫,對緩解UC癥狀以及維持緩解有較好的療效。

表2 不同益生菌對UC的影響Table 2 Effect of probiotics on UC

2004 年,Kruis等進行一項納入327 名UC患者的雙盲實驗,患者接受益生菌或美沙拉嗪治療,結果發現益生菌大腸桿菌Nissle 1917與美沙拉嗪療效相似[50]。現在大腸桿菌Nissle 1917已經被認為是5-氨基水楊酸鹽有效代替物。大量VSL#3（短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、物乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）對UC患者治療效果的研究被報道。Fedorak等研究發現VSL#3對34 例輕度-中度的成年UC患者效果良好,且無不良影響[51]。Venturi等評估了VSL#3對20 例不耐受5-ASA及過敏的UC患者的積極影響,還進行了VSL#3對新診斷的UC兒童患者療效的評估[52]。此外,一項對187 例UC患者的研究顯示,鼠李糖乳桿菌對此有良好的治療效果[53]。Mallon等稱益生菌對輕中度UC患者維持緩解有積極作用[54]。盡管關于益生菌在UC治療中積極結果不斷被報道,但其機制需進一步研究深入。

2.2 益生菌的作用機制

2.2.1 調節免疫反應、抑制炎癥

UC是由免疫系統介導的慢性炎癥,細胞因子可以協調腸道內免疫和非免疫細胞間的溝通,并改變局部及全身水平的急慢性炎癥反應,作為細胞信號因子通過刺激促炎介質產生和激活炎癥通路在UC發病機制中起關鍵作用（表3）。

表3 不同細胞因子在UC中的作用[61-62]Table 3 Roles of different cytokines in UC[61-62]

研究表明,益生菌通過抑制TLR4/NF-κB信號通路和磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶/NF-κB信號通路,降低TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子水平,提高IL-10等抗炎因子水平,從而維持UC的緩解[55]。一項納入167 項口服益生菌或合成制劑一周以上的對照臨床實驗,對炎癥性腸病、關節炎和脂肪肝等炎癥標志物（C-反應蛋白（C-reactive protein,CRP）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、轉化生長因子-β）進行系統回顧和薈萃分析,結果發現益生菌可以顯著降低IBD患者血清中CRP和TNF-α水平,但不改變IL-10水平[56]。植物乳桿菌KLDS00170、嗜酸乳桿菌KLDS20010和瑞士乳桿菌KLDS10010 3 種混合益生菌能夠顯著降低小鼠結腸及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量,提高IL-10含量。提示益生菌通過降低局部及全身炎癥,改善結腸炎[57]。植物乳桿菌LP可改善IL-10基因敲除小鼠結腸炎的嚴重程度[58]。副干酪乳桿菌LS2通過減少固有層中Th1細胞和巨噬細胞的數量緩解結腸炎[59]。嗜酸乳桿菌可降低葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium salt,DSS）誘導小鼠結腸組織中信號傳導及轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription,STAT3）和磷酸化STAT3水平,并增加2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS）誘導小鼠腸上皮及固有層淋巴細胞中Treg細胞的數量[60],從而減輕炎癥。

2.2.2 增強腸道黏膜屏障

完整的腸黏膜屏障由機械屏障（由腸道黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接和黏液層構成）、化學屏障（由胃酸、膽汁、消化酶、溶菌酶、黏多糖、糖蛋白、蛋白質等構成）、免疫屏障（由免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）A、IgG和IgM等構成）與生物屏障（由約1013～1014CFU細菌組成,深層菌膜群由雙歧桿菌、乳酸桿菌等組成；表層腔菌群由大腸桿菌、腸球菌等組成）共同構成[66],能夠防止腸內的有害物質如細菌和毒素穿過腸黏膜進入人體內其他組織、器官和血液循環。腸道免疫功能主要靠腸道黏膜屏障實現,免疫、生物、理化等各種因素損傷腸道黏膜屏障功能,腸道內將出現細菌易位、內毒素吸收等現象。在UC患者體內,結腸黏膜屏障已被破壞,腸道表面菌群失衡,腸上皮細胞大量凋亡,引起腸道局部環境免疫紊亂。

益生菌通過與上皮細胞互作,減少水的分泌,增強黏液或抗菌肽的產生,如β-防御素、溶菌酶、乳鐵蛋白或磷脂酶等。VSL＃3能夠使IL-10缺陷型小鼠保持腸上皮細胞完整性,恢復受損結腸屏障功能,增強T-84細胞上皮抗性[63]。植物乳桿菌ZS2058能夠上調結腸炎小鼠模型的腸上皮細胞黏蛋白MUC2、緊密連接蛋白Claudin3、ZO-1和E-cadherin1的mRNA表達,增強黏液層,從而改善屏障功能[64]。乳酸乳桿菌HT121-2可以顯著提高DSS誘導的結腸炎小鼠結腸內再生胰島衍生蛋白Reg3γ相對表達,Reg3γ是一種抗微生物肽,其分泌緩解腸炎癥狀（包括降低炎癥因子水平和改善腸黏膜病理變化等）,維護腸黏膜屏障。此外,益生菌通過調節腸黏膜上細菌平衡,增強生物屏障。Siaw等在研究116 例緩解期UC患者和16 例健康者的糞便菌群中,發現UC患者中F.prausnitzii定植數量顯著減少,且UC患者口服F.prausnitzii后,腸道內F.prausnitzii定植增加,抑制病原菌定植和入侵,有助于UC的緩解[65]。

2.2.3 抑制氧化應激反應

過度的氧化應激反應參與UC的發病。研究發現,過度氧化與腸道黏膜中性粒細胞的活化和募集密切相關,在UC患者的結腸中,吞噬白細胞的活性顯著增加,導致自由基分子數量升高[67],從而會導致DNA、蛋白質和脂肪嚴重受損。UC患者抗氧化能力不足,可能是由于體內過度炎癥導致（圖2）[68]。對UC患者的藥理學干預也證實了氧化應激在該疾病中的作用。例如,5-氨基水楊酸的治療機制部分是由于抗氧化作用,鐵螯合作用和自由基清除作用[69]。

圖2 UC體內過度氧化[70]Fig.2 Over-oxidation in patients with UC[70]

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是抗氧化自由基的第一道防線,能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫[71]。研究顯示,SOD的使用可顯著降低發炎結腸中的過氧化反應,且改善TNBS誘導的大鼠結腸炎模型[72]。在一項研究中,高產SOD的植物乳桿菌和乳酸乳球菌可以顯著降低TNBS結腸炎模型的炎癥反應[73]。另一項實驗研究表明,產生錳SOD的加氏乳桿菌具有抗炎活性,可降低IL-10缺陷小鼠的結腸炎嚴重程度[74]。此外發酵乳桿菌E-3、發酵乳桿菌E-18和嗜熱鏈球菌由于產生SOD而顯示具有抗氧化活性[75]。

研究發現益生菌能夠調控與氧化應激相關的信號通路以緩解氧化損傷,主要調控核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element,ARE）（圖3）。人體在正常狀態下,Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1,keap1）在細胞質中以結合狀態存在,當發生氧化應激時,Nrf2與keap1分離,進入細胞核內,與ARE結合,誘導抗氧化酶或抗氧化蛋白表達[76]。在UC小鼠模型中,植物乳桿菌ZDY2013和兩歧雙歧桿菌WBIN03通過激活Nrf2通路,調節SOD1、谷胱甘肽過氧化物酶2、過氧化氫酶抗氧化酶的分泌,達到緩解結腸炎的效果[77]。

研究表明,MPO髓過氧化物酶是氧化應激標志之一,結腸發生炎癥后大量中性粒細胞內流進入組織使MPO活力大幅度提高。植物乳桿菌YS-2[78]、植物乳桿菌Zhang-LL[79]可以顯著提高小鼠結腸內MPO活性,提示益生菌可能通過降低MPO活性來減輕氧化程度。

圖3 益生菌干預Nrf2/ARE途徑[80]Fig.3 Nrf2/ARE signaling pathway for probiotic intervention[80]

然而,益生菌干預UC患者的效果并不一致。研究表明益生菌加劇腸道蠕動,加重UC腹瀉,增加排便次數和DAI。Wildt等[81]研究發現,給予嗜酸乳桿菌LA-5和動物雙歧桿菌BB-12組與安慰劑對照組對UC患者的緩解效果無顯著差異。仍需要更多的樣本量和隨機對照臨床實驗來闡明益生菌在UC治療中的作用機制。

3 結 語

隨著對腸道菌群-宿主之間相互作用研究越來越深入,發現腸道微生物與潰瘍性結腸炎密切相關,以腸道菌群為靶點為治療潰瘍性結腸炎提供新的途徑。無論臨床研究或動物研究,益生菌在改善潰瘍性結腸炎中都展現出良好的干預效果,但也有研究發現益生菌對潰瘍性結腸炎沒有顯著效果甚至加重病情。此外,由于UC發病機制復雜,再加上益生菌個體差異、種類和治療劑量不同甚至益生菌自身的生長狀態的不同導致益生菌治療效果有所差異。因此,仍需大量深入研究為益生菌的有益效果提供合理詳細的證據。