4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮抗血小板聚集機制研究

單一桓，鄧 楠，祁真平，左 華

（西南大學藥學院，重慶 400716）

0 引言

血液中凝血和抗凝血、纖溶和抗纖溶的動態平衡維持著血液的流動性。在正常循環血液中，血小板處于靜息狀態。當凝血功能和抗凝血功能失去平衡時，血小板就會受到刺激，發生變性、黏附、釋放、聚集等活化反應，引發血栓形成［1］，進而導致缺血性腦卒中、心肌梗塞等心、腦、肺循環系統疾病，嚴重危害人類生命健康［2-3］。

抗血小板聚集藥物能夠有效預防血栓的形成。目前常用的抗血小板藥物主要有4類：（1）影響花生四烯酸代謝藥物；（2）P2Y12受體拮抗劑；（3）血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑；（4）磷酸二酯酶抑制劑［4］。近幾年研究發現，苯并噁嗪酮衍生物具有高效的抗血小板聚集作用［5-7］。Ila?等［8］合成了一系列2H-1，4-苯并噁嗪衍生物并證實了該類化合物具有理想的Ⅱb/Ⅲa受體拮抗作用。本課題組的前期研究表明，2H-1，4-苯并噁嗪酮類衍生物具有血小板聚集抑制活性，為血栓性疾病的防治帶來了新的突破［9-12］。本文在此基礎上，對4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮（見圖1）的抗血小板聚集機制進行了研究。

圖1 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮的化學結構式

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭兔，雄性八只，購自重慶市南山中藥研究院。2018年3月至6月，在西南大學藥學院動物房飼養，期間自由進食和飲水，每天照明12小時（8：00—20：00）。

1.2 實驗材料

4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮，由本實驗室合成。枸櫞酸鈉，采購自天津瑞金特化學品有限公司。膠原Ⅰ購自美國Sigma-Aldrich公司。氯化鈉、PBS（pH7.4），采購自成都市科龍化工試劑廠。DMSO購自重慶川東化工有限公司。TXB2、5-HTELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。阿司匹林腸溶片購自德國拜耳醫藥保健有限公司。鹽酸沙格雷酯片購自日本田邊三菱制藥株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗樣品的制備

用0.1%DMSO溶液將4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮（由本實驗室前期合成［12］）配制成濃度10μM的溶液；陽性對照藥品（阿司匹林、鹽酸沙格雷酯）用0.1%DMSO溶液配制成濃度100μM的儲備液，4°C保存備用；配制3.8%（W/V）枸櫞酸鈉溶液作為抗凝劑；膠原Ⅰ用PBS溶液配置成濃度4μg/mL的溶液作為誘導劑，4℃保存備用。

1.3.2 血漿樣品的制備

每次實驗采取同一只兔子的血液，以避免兔子個體差異的影響。將兔子仰臥固定好，心臟動脈采血。加入抗凝劑3.8%枸櫞酸鈉溶液，以抗凝劑∶血液=1∶9（V∶V）的比例抗凝。將血液樣品在室溫下以800 rpm轉速離心10 min，小心吸取上層清液，即得到富血小板血漿（PRP）。將剩下的血以3 000 rpm的轉速離心15 min，得到貧血小板血漿（PPP）。最后用PPP調整PRP的血小板數量至（200±50）×106/mL。整個流程必須在3 h內完成［9］。

1.3.3 血小板中血栓素TXB2的變化

空白對照組、陽性對照組和實驗組，每組進行3次重復試驗。在9個EP管分別加入170μL配制好的富血小板血漿（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL的膠原Ⅰ誘導劑，37℃下反應5 min，往相應管中加入20μL 0.01%的DMSO空白對照溶液、20μL 10μM陽性對照藥物阿司匹林溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮DMSO溶液，37℃水浴中孵育5min后取出。以3 000 rpm轉速在4℃下離心30 min，取10μL上清液作為測定TXB2的樣品，按照TXB2ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定450 nm下的OD值，計算樣品濃度。

1.3.4 血小板中5-HT的變化

空白對照組、陽性對照組和實驗組，每組進行3次重復試驗。在9個EP管中分別加入170μL配制好的富血小板血漿（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL膠原Ⅰ誘導劑，37℃水浴中孵育5 min。往相應管中加入空白對照溶液0.01%的DMSO水溶液20μL、陽性對照藥物鹽酸沙格雷酯溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮溶液20μL，37℃水浴中孵育5 min后取出，以3 000 rpm轉速在4℃離心30 min，取10μL上清液作為測定5-HT的樣品，按照5-HTELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀測定450 nm下的OD值，計算樣品濃度。

1.4 統計學處理

用Excel軟件計算均值和標準差，SPSS軟件計算P值。計量資料以x±s表示，采用t檢驗方法進行組間差異比較，以P<0.05為差異作為具有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 血小板中血栓素TXB2釋放量的變化

TXB2標準品濃度與OD值的標準曲線如圖2所示，OD值與TXB2標準品濃度的線性方程為y=0.003 4x，相關系數r=0.979 1，TXB2釋放量與OD值具有線性相關性。

圖2 TXB2（釋放量）標準曲線

空白對照組、陽性對照組（10μM）和實驗組（10 μM）的TXB2釋放量（x±s）分別為 186.8±31.2，111.8±16.5和76.5±6.9（pg/mL）（見圖3）。按照公式（1）和公式（2）計算得：對于TXB2的釋放量，陽性對照組比空白對照組低40%，實驗組比空白對照組低59.0%，且P<0.05，具有統計學意義，說明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮具有顯著的抑制血小板TXB2釋放的作用。

圖3 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮對血小板中TXB2釋放量的影響

2.2 血小板中5-HT的釋放量實驗結果

5-HT標準品濃度與OD值的標準曲線如圖4所示，OD值與5-HT標準品濃度的線性方程為y=0.021 4x，相關系數r=0.996 1，5-HT釋放量與OD值具有線性相關性。

圖4 5-HT釋放量標準曲線

空白對照組、陽性對照組（10μM）和實驗組（10 μM）的5-HT釋放量（pg/mL）（±s）分別為63.8±0.5，76.5±6.3和77.2±1.9（見圖5）。對于5-HT釋放量，按照公式（3）和（4）得：陽性對照組比空白對照組高19.8%，實驗組比空白對照組高21.0%，且P<0.05，具有統計學意義，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮能夠抑制5-HT與其受體結合，進而抑制血小板聚集。

圖5 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮對血小板中5-HT釋放量的影響

3 討論

目前心血管疾病如急性心肌梗死、腦卒中等，已被列為嚴重危害人類健康的疾病，該類疾病與血栓栓塞密切相關。血小板在血栓的形成和發展階段起著核心作用，所以抗血小板聚集藥物能夠有效地預防栓塞，治療心血管疾病。目前有文獻報道［13］，2H-1，4苯并噁嗪酮類化合物具有理想的GPⅡb/Ⅲa受體拮抗作用，但是對于其不同衍生物的抗血小板聚集的機制仍需進一步研究。針對血小板聚集過程中產生的一系列反應如花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA）代謝、產生血栓烷A2（TXA2）并激活血小板上的A2受體、釋放出ADP、5-HT等導致血小板GPⅡb/Ⅲa復合物的構型改變、形成黏附分子受體并通過與纖維蛋白原的結合而使血小板之間相互黏附和聚集成團,在血管破損處形成早期止血血栓，我們研究了其中兩種可能的抗血小板聚集機制：抑制血小板TXB2的釋放和阻斷5-HT與其受體的結合［14］。

本研究顯示，4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮顯著減少了膠原誘導產生的TXB2的含量。TXB2是由TXA2代謝形成的穩定產物［15］，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮能夠顯著抑制TXB2的釋放，進而抑制血小板的聚集。5-HT可以通過與G-蛋白偶聯受體結合發揮生理功能引起血管收縮，導致血栓形成［11］。4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮作用于膠原誘導后的血小板時，5-HT的含量顯著增加，說明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮阻斷了5-HT與G-蛋白偶聯受體的結合，使游離的5-HT增多，進而抑制血小板的聚集。

綜上所述，化合物4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮可以通過抑制血小板TXB2的釋放以及阻斷5-HT與其受體結合的機制來抑制血小板聚集，且抑制血小板TXB2釋放的機制作用更顯著。