4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮抗血小板聚集機制研究

單一桓，鄧 楠，祁真平，左 華

（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716）

0 引言

血液中凝血和抗凝血、纖溶和抗纖溶的動態(tài)平衡維持著血液的流動性。在正常循環(huán)血液中，血小板處于靜息狀態(tài)。當(dāng)凝血功能和抗凝血功能失去平衡時，血小板就會受到刺激，發(fā)生變性、黏附、釋放、聚集等活化反應(yīng)，引發(fā)血栓形成［1］，進(jìn)而導(dǎo)致缺血性腦卒中、心肌梗塞等心、腦、肺循環(huán)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害人類生命健康［2-3］。

抗血小板聚集藥物能夠有效預(yù)防血栓的形成。目前常用的抗血小板藥物主要有4類：（1）影響花生四烯酸代謝藥物；（2）P2Y12受體拮抗劑；（3）血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑；（4）磷酸二酯酶抑制劑［4］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，苯并噁嗪酮衍生物具有高效的抗血小板聚集作用［5-7］。Ila?等［8］合成了一系列2H-1，4-苯并噁嗪衍生物并證實了該類化合物具有理想的Ⅱb/Ⅲa受體拮抗作用。本課題組的前期研究表明，2H-1，4-苯并噁嗪酮類衍生物具有血小板聚集抑制活性，為血栓性疾病的防治帶來了新的突破［9-12］。本文在此基礎(chǔ)上，對4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮（見圖1）的抗血小板聚集機制進(jìn)行了研究。

圖1 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭兔，雄性八只，購自重慶市南山中藥研究院。2018年3月至6月，在西南大學(xué)藥學(xué)院動物房飼養(yǎng)，期間自由進(jìn)食和飲水，每天照明12小時（8：00—20：00）。

1.2 實驗材料

4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮，由本實驗室合成。枸櫞酸鈉，采購自天津瑞金特化學(xué)品有限公司。膠原Ⅰ購自美國Sigma-Aldrich公司。氯化鈉、PBS（pH7.4），采購自成都市科龍化工試劑廠。DMSO購自重慶川東化工有限公司。TXB2、5-HTELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。阿司匹林腸溶片購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司。鹽酸沙格雷酯片購自日本田邊三菱制藥株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗樣品的制備

用0.1%DMSO溶液將4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮（由本實驗室前期合成［12］）配制成濃度10μM的溶液；陽性對照藥品（阿司匹林、鹽酸沙格雷酯）用0.1%DMSO溶液配制成濃度100μM的儲備液，4°C保存?zhèn)溆茫慌渲?.8%（W/V）枸櫞酸鈉溶液作為抗凝劑；膠原Ⅰ用PBS溶液配置成濃度4μg/mL的溶液作為誘導(dǎo)劑，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血漿樣品的制備

每次實驗采取同一只兔子的血液，以避免兔子個體差異的影響。將兔子仰臥固定好，心臟動脈采血。加入抗凝劑3.8%枸櫞酸鈉溶液，以抗凝劑∶血液=1∶9（V∶V）的比例抗凝。將血液樣品在室溫下以800 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min，小心吸取上層清液，即得到富血小板血漿（PRP）。將剩下的血以3 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心15 min，得到貧血小板血漿（PPP）。最后用PPP調(diào)整PRP的血小板數(shù)量至（200±50）×106/mL。整個流程必須在3 h內(nèi)完成［9］。

1.3.3 血小板中血栓素TXB2的變化

空白對照組、陽性對照組和實驗組，每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗。在9個EP管分別加入170μL配制好的富血小板血漿（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL的膠原Ⅰ誘導(dǎo)劑，37℃下反應(yīng)5 min，往相應(yīng)管中加入20μL 0.01%的DMSO空白對照溶液、20μL 10μM陽性對照藥物阿司匹林溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮DMSO溶液，37℃水浴中孵育5min后取出。以3 000 rpm轉(zhuǎn)速在4℃下離心30 min，取10μL上清液作為測定TXB2的樣品，按照TXB2ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定450 nm下的OD值，計算樣品濃度。

1.3.4 血小板中5-HT的變化

空白對照組、陽性對照組和實驗組，每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗。在9個EP管中分別加入170μL配制好的富血小板血漿（PRP），在37℃水浴中孵育5 min。然后在各管中加入10μL 4μg/mL膠原Ⅰ誘導(dǎo)劑，37℃水浴中孵育5 min。往相應(yīng)管中加入空白對照溶液0.01%的DMSO水溶液20μL、陽性對照藥物鹽酸沙格雷酯溶液、20μL 10μM的4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮溶液20μL，37℃水浴中孵育5 min后取出，以3 000 rpm轉(zhuǎn)速在4℃離心30 min，取10μL上清液作為測定5-HT的樣品，按照5-HTELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測定450 nm下的OD值，計算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用Excel軟件計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS軟件計算P值。計量資料以x±s表示，采用t檢驗方法進(jìn)行組間差異比較，以P<0.05為差異作為具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血小板中血栓素TXB2釋放量的變化

TXB2標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，OD值與TXB2標(biāo)準(zhǔn)品濃度的線性方程為y=0.003 4x，相關(guān)系數(shù)r=0.979 1，TXB2釋放量與OD值具有線性相關(guān)性。

圖2 TXB2（釋放量）標(biāo)準(zhǔn)曲線

空白對照組、陽性對照組（10μM）和實驗組（10 μM）的TXB2釋放量（x±s）分別為 186.8±31.2，111.8±16.5和76.5±6.9（pg/mL）（見圖3）。按照公式（1）和公式（2）計算得：對于TXB2的釋放量，陽性對照組比空白對照組低40%，實驗組比空白對照組低59.0%，且P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮具有顯著的抑制血小板TXB2釋放的作用。

圖3 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮對血小板中TXB2釋放量的影響

2.2 血小板中5-HT的釋放量實驗結(jié)果

5-HT標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，OD值與5-HT標(biāo)準(zhǔn)品濃度的線性方程為y=0.021 4x，相關(guān)系數(shù)r=0.996 1，5-HT釋放量與OD值具有線性相關(guān)性。

圖4 5-HT釋放量標(biāo)準(zhǔn)曲線

空白對照組、陽性對照組（10μM）和實驗組（10 μM）的5-HT釋放量（pg/mL）（±s）分別為63.8±0.5，76.5±6.3和77.2±1.9（見圖5）。對于5-HT釋放量，按照公式（3）和（4）得：陽性對照組比空白對照組高19.8%，實驗組比空白對照組高21.0%，且P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮能夠抑制5-HT與其受體結(jié)合，進(jìn)而抑制血小板聚集。

圖5 4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮對血小板中5-HT釋放量的影響

3 討論

目前心血管疾病如急性心肌梗死、腦卒中等，已被列為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，該類疾病與血栓栓塞密切相關(guān)。血小板在血栓的形成和發(fā)展階段起著核心作用，所以抗血小板聚集藥物能夠有效地預(yù)防栓塞，治療心血管疾病。目前有文獻(xiàn)報道［13］，2H-1，4苯并噁嗪酮類化合物具有理想的GPⅡb/Ⅲa受體拮抗作用，但是對于其不同衍生物的抗血小板聚集的機制仍需進(jìn)一步研究。針對血小板聚集過程中產(chǎn)生的一系列反應(yīng)如花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA）代謝、產(chǎn)生血栓烷A2（TXA2）并激活血小板上的A2受體、釋放出ADP、5-HT等導(dǎo)致血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的構(gòu)型改變、形成黏附分子受體并通過與纖維蛋白原的結(jié)合而使血小板之間相互黏附和聚集成團(tuán),在血管破損處形成早期止血血栓，我們研究了其中兩種可能的抗血小板聚集機制：抑制血小板TXB2的釋放和阻斷5-HT與其受體的結(jié)合［14］。

本研究顯示，4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮顯著減少了膠原誘導(dǎo)產(chǎn)生的TXB2的含量。TXB2是由TXA2代謝形成的穩(wěn)定產(chǎn)物［15］，表明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮能夠顯著抑制TXB2的釋放，進(jìn)而抑制血小板的聚集。5-HT可以通過與G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮生理功能引起血管收縮，導(dǎo)致血栓形成［11］。4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮作用于膠原誘導(dǎo)后的血小板時，5-HT的含量顯著增加，說明4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮阻斷了5-HT與G-蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合，使游離的5-HT增多，進(jìn)而抑制血小板的聚集。

綜上所述，化合物4-乙基-7-［2-（4-甲基哌嗪基）乙酰胺基］-3，4-二氫-1，4-苯并噁嗪-3-酮可以通過抑制血小板TXB2的釋放以及阻斷5-HT與其受體結(jié)合的機制來抑制血小板聚集，且抑制血小板TXB2釋放的機制作用更顯著。