光遺傳學技術在睡眠-覺醒相關神經核團及環路研究中的應用綜述

孫 華，郭永馨，張文娟，仝 黎

解放軍總醫院第一醫學中心 麻醉手術中心，北京 100853

睡眠是高等脊椎動物普遍的生理機制，并且是維持人體特別是大腦功能所必需的一種行為。在日常生活中睡眠不足會導致疲憊、記憶力和注意力下降。在動物實驗中，長時間的睡眠剝奪最終會誘發動物免疫力下降、運動能力下降、體溫調節機制紊亂、下丘腦功能嚴重紊亂，甚至導致多器官功能不全而死亡[1]。睡眠紊亂的相關疾病也是困擾患者的棘手問題。因此有許多神經科學研究步入睡眠與覺醒調節機制的領域，開展了許多關于睡眠-覺醒神經核團及環路研究。在這些研究中，應用了多種神經生物學以及細胞生物學方法，如電生理、熒光標記、鈣成像技術、免疫組化技術、手術切除相應核團以及應用各種神經遞質受體的激動劑和拮抗劑等。在眾多方法中，光遺傳學技術近年來脫穎而出。2005 年Deisseroth 的實驗室第一次把視紫紅質通道蛋白2(ChR2)表達于離體哺乳動物海馬神經細胞中，控制其電活動以及神經遞質釋放[2]。之后光遺傳學技術飛速發展，結合了基因工程技術和前沿的光學技術在動物實驗中廣泛應用。由于其可在特定時間、特定細胞精確性表達而成為時下生命科學以及神經科學研究的有力工具。本文就光遺傳學技術應用于睡眠-覺醒神經核團及環路研究的成果進行綜述。

1 光遺傳學技術在睡眠覺醒核團研究中的應用

光遺傳學技術對腦區睡眠覺醒的核團進行光刺激，需要在特異性的細胞中找到合適的光遺傳蛋白表達，根據實驗目的進行蛋白工具的選擇，興奮性的視蛋白主要有ChR2，抑制性的視蛋白主要有NpHR(嗜鹽菌紫質)和Arch(蘇打紅鹽菌的視蛋白)等[3-4]。視蛋白需與某一種熒光蛋白如黃色熒光蛋白(YFP)、增強型綠色熒光蛋白(GFP)和增強型紅色熒光蛋白(mCherry)等同時表達，以檢驗其是否正常表達同時便于觀察神經元和神經環路的具體位置。這些已經選定的視蛋白和熒光蛋白結合的基因片段需要通過特殊的病毒載體轉染于目標神經細胞。載體包括腺相關病毒、慢病毒等。為了特異性表達，同時還需要基因工程技術將含有Cre 酶的基因片段表達于相關特異性細胞中，如膽堿能神經元、GABA 能神經元、Orexin 能神經元等調節睡眠覺醒的神經元中。最近的一項動物研究發現，一種犬腺病毒2 載體可以注射于小鼠腦內神經元軸突末端的區域，經過長距離的逆行性轉導，使所有神經元胞體表達視蛋白[5]。在上述工作完成后就需要在相應部位置入光纖導管，根據視蛋白種類選擇不同波長的光來刺激動物的特定區域，實現神經元的快速興奮或抑制，而光刺激模式的選擇則需要結合不同的神經元類型在實驗中摸索。有研究者也發明了無線光遺傳學技術，將胡椒大小的電子器件置入小鼠大腦，無線光刺激后對小鼠的運動產生影響，可以減少對小鼠正常活動的干擾[6]。這一技術可以對小鼠睡眠環境產生更小的影響，與光纖導管相比有著獨特的優勢。

2 利用光遺傳學技術研究下丘腦的神經核團

下丘腦是調節內臟活動和內分泌活動的較高級神經中樞，調節體溫、攝食、睡眠、水鹽平衡和內分泌腺活動等重要的生理功能。在以往研究中睡眠覺醒調節核團主要位于腹外側視交叉前區(ventrolateral preoptic area，VLPO)、 下 丘 腦 外 側區黑色素聚集激素神經元(melanin-concentrating hormone，MCH)、下丘腦外側區食欲肽(Orexin)神經元和結節乳頭核(tuberomammillary nucleus，TMN)中[7]。這些核團相互影響，共同參與了睡眠覺醒的調節。

20 世紀末研究者們發現了食欲肽(Orexin)及其受體在調節神經活性和調節攝食行為方面的作用[8]。之后在動物在體實驗中又有研究發現這種神經元及受體還參與了睡眠與覺醒的轉換，并運用基因敲除技術敲除Orexin 基因研究其對睡眠狀態的影響[9-10]。在這些理論的基礎上，Ferrari 等[11]將攜帶有編碼VGAT 啟動子和ChR2 的慢病毒注射在轉基因小鼠的下丘腦外側區，采用光遺傳學技術調控投射在該區域的Orexin 能神經元的GABA能神經元軸突末梢，從而調控動物在睡眠到覺醒狀態的轉換。另有研究者采用小鼠動物模型利用光遺傳學技術激活中縫背核(dorsal raphe nucleus，DRN)區五羥色胺能(5-HT)神經元，記錄Orexin 能神經元的突觸后反應，結果顯示5-HT 神經元可能通過5HT1A 受體直接抑制Orexin 能神經元，也可能通過調控GABA 能神經元間接抑制Orexin 能神經元，進而調節動物的清醒狀態以及睡眠狀態[12]。此外也有在體研究用光遺傳刺激該核團，來研究其與應激焦慮相關的行為學表現，同時也引起了睡眠向覺醒的改變[13]。總之，Orexin 能神經元因其在腦內投射廣泛，在未來的神經環路研究中仍有著重要的意義。

下丘腦外側區MCH 神經元與Orexin 能神經元在腦內投射區域基本相似，與Orexin 能神經元在睡眠覺醒調節中有著互補的作用。在體動物實驗中用光遺傳學方法刺激MCH 神經元可增加非快速動眼睡眠期(non-rapid eye movement sleep，NREM)及快速動眼睡眠期(rapid eye movement sleep，REM)的睡眠時間[14]。2016 年有研究結果顯示，在大鼠下丘腦注射攜帶ChR2 的病毒，利用光遺傳學技術分別采用5 Hz、10 Hz 和30 Hz 的藍光特異性激活MCH 神經元，可增加夜晚REM 期及NREM 期的睡眠時間，白晝期間僅REM 期睡眠增加[14]。也有在體研究指出在光刺激MCH 后NREM 期增加并且腦電圖分析出現穩定的慢波Delta 波，以上兩種研究的不同結果可能是與刺激的頻率方式以及刺激部位不同導致的。MCH 神經元既可促進NREM 向REM 期的轉換，同時也對NREM 期睡眠的產生和維持發揮作用[15]。

MCH 神經元被認為是一種GABA 能神經元，釋放GABA 抑制下游神經元，最近有研究證實用光遺傳學刺激中隔核外側區(lateral septal nucleus，LS)的MCH 神經元軸突末端，通過電生理指標發現MCH 神經元向LS 區投射釋放谷氨酸使LS 激活，而谷氨酸同時激活了其他部位的GABA 能神經元，這些GABA 能神經元也投射到LS 區并形成了的前饋抑制機制[16]。之前研究發現只有在睡眠期才可以觀察到MCH 神經元的活動，最近有證據表明它在覺醒期也有神經活動[17]。上述發現證明MCH 神經元不只是一種GABA 能神經元而且還釋放谷氨酸影響下游神經元，可能參與覺醒期的調節，未來也可以研究MCH 神經元與Orexin 之間是否存在協同作用，并尋找在覺醒期調節方面的相關環路。 結節乳頭核是中樞神經系統中組胺的唯一來源，雖然已經知道腹外側視交叉前區是主要的睡眠激活中心[18]，也知道組胺能神經元在覺醒中的作用[19]，但仍然不知道哪些神經環路參與其中。Williams 等[20]將光遺傳學技術與電生理技術結合來探究TMN 區組胺能神經元與VLPO 區GABA 能神經元在促進覺醒功能中的神經環路，用組氨酸脫羧酶-Cre 小鼠結合ChR2-mCherry 表達在結節乳頭核腹外側區(vlTMN)的組胺能神經元，在光刺激相應區域后可以用電生理技術記錄vlTMN 神經元和VLPO 神經元中的自發抑制性突觸后電流(sIPSC)，發現從TMN 區釋放的組胺通過H3 受體可以減少GABA 能神經元向vlTMN 神經元的傳入從而對自身進行去抑制，并且組胺能神經元可以通過H1 受體激活GABA 中間神經元從而抑制VLPO 區GABA 能神經元對vlTMN 區的抑制，以激活TMN 區神經細胞。VLPO 區神經元和TMN 區神經元彼此相互抑制，激活一個相應的會抑制另外一個的表達。這一結果驗證了之前研究中睡眠與覺醒調節的“觸發開關”假說，使睡眠或覺醒狀態轉換迅速[9]。Neuron 的一篇小鼠在體光遺傳學研究顯示，組胺能神經元以旁分泌形式釋放GABA來參與睡眠調節，敲除轉基因小鼠組胺能神經元中的VGAT 基因(編碼GABA 轉運體)可導致覺醒期額外增加[21]。這樣的自身調節機制可能是為了使睡眠覺醒趨于一個穩定的狀態，防止組胺能神經過度激活，導致睡眠覺醒調節神經網絡紊亂。也許其他神經元中也有類似的機制，使大腦中神經環路調節穩定。

3 用光遺傳學技術研究丘腦網狀核與丘腦皮質環路

丘腦網狀核(thalamic reticular nucleus，TRN)是位于丘腦與皮質之間的GABA 能抑制性神經核團，參與感覺的加工、注意力控制、睡眠覺醒的調節[22]。睡眠梭形波產生于丘腦皮質環路中，是在NREM 睡眠期觀察到的特征性腦電圖節律，頻率為7 ～ 15 Hz。用光遺傳學方法刺激轉基因(VGAT-ChR2)小鼠TRN 神經元，同時記錄皮質腦電圖，發現刺激頻率不同形成的腦電圖波形也不同，最終確定了最有效的激發皮質睡眠梭形波的光刺激模式，產生在結構與功能上與自發睡眠梭形波相似的波形，這些波形延長了NREM 期睡眠時間，并且波形密度與睡眠時間相關[23]。這進一步證實了丘腦是感覺信息中繼站，睡眠梭形波可能通過阻止外界感覺信息傳入來增加睡眠穩定性以此維持睡眠。由此可以看出，丘腦皮質神經環路是睡眠調節網絡的重要部分。Lewis 等[24]用光遺傳學技術刺激TRN 區可在腦電圖中檢測到慢波，并減少了覺醒狀態的持續時間，可以對皮質的狀態進行快速調節。也有在體動物光遺傳學研究表明LH-GABA 神經元投射抑制性信號控制TRNGABA 神經元形成前饋抑制的環路，用光遺傳刺激該神經環路中LH-GABA 神經元可在NREM 期抑制TRN 神經元活性從而引起覺醒，在REM 期則沒有顯著變化，同時也可以引起深度麻醉中的覺醒。而用光遺傳蛋白Arch 抑制該環路則可以增加小鼠NREM 睡眠持續時間，使NREM 期睡眠穩定，腦電圖分析顯示Delta 波增多。在立體定位儀下注射有CHETA-EYFP 片段的腺相關病毒，結合病毒示蹤技術發現了LH-GABA 與TRN 前后區域都有單突觸聯系。用Arch 蛋白抑制TRN 細胞也可引起NREM 期覺醒[25]。以往的研究指出膽堿能神經元與REM 期產生有關，參與促覺醒作用。但最新研究顯示應用光遺傳學技術刺激傳入TRN 的膽堿能神經元會激活GABA 能神經元而引起睡眠[26]。繼續深入研究TRN 區與其他核團的聯系仍需借助光遺傳學手段。

丘腦室旁核(thalamic paraventricular nucleus，PVT)也成為近年來研究的熱點，利用光遺傳學技術可發現丘腦室旁核中谷氨酸能神經元促進了睡眠向覺醒的轉換，而這一促覺醒作用可能與下丘腦外側區中Orexin 能神經元向該區域的投射相關[27]。

4 用光遺傳學技術研究中腦腹側背蓋區神經核團

之前對于中腦腹側背蓋區(ventral tegmental area，VTA)的研究主要集中于機體的獎賞機制、成癮現象以及恐懼記憶的形成[28-30]。近些年VTA核團參與睡眠機制的調節逐漸受到關注。一項發表于PNAS 的研究結果證實，通過光遺傳學特異性激活VTA 核團多巴胺神經元能夠促進動物從麻醉狀態向覺醒狀態轉換，首次為VTA 核團多巴胺神經元參與全麻藥物誘導的麻醉效應向覺醒過程轉換的作用機制提供了證據[31]。有研究報道利用光遺傳技術特異性激活小鼠VTA 區的谷氨酸能神經元可以使覺醒期和REM 期延長，產生促進覺醒的作用；相反激活VTA 區GABA 能神經元則能維持長時間的NREM 睡眠期，如果將這些神經元損毀則能增加清醒期長達4 個月[32]。VTA 核團的神經元種類復雜，可能通過投射到下游的伏隔核(nucleus accumbens，NAc)或下丘腦發揮調解睡眠的作用。

5 結語

光遺傳學技術已經廣泛應用于調節睡眠覺醒的神經核團和環路研究中。光遺傳方法與傳統的電刺激方法相比，一個主要的優點就在于它可以對動物進行最小的干預、在特定的時間窗來激活神經細胞活性，也可以減少睡眠狀態轉換的潛伏期并減小實驗結果的變異性，在科學性上更具有說服力。在具體應用時，也需要結合上述方法和其他生命、神經科學領域前沿的多種方法如腦功能性MRI、化學遺傳學方法綜合應用以達到實驗目的。未來需要繼續開發創新光遺傳學技術以更加深入地研究睡眠覺醒的調節機制，幫助人類攻克失眠、嗜睡等臨床問題，并對全身麻醉的機制進行更深入的研究。