齊墩果酸A環衍生物的合成與體外抗腫瘤活性研究

王 強， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種五環三萜類化合物，在自然界中分布廣泛，主要以游離或與糖結合成糖苷的形式存在.OA具有廣泛的生物活性，如護肝、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤等[1-4].OA結構中可供修飾的位點有限，研究主要集中在A環、C環、C-3和C-28位，對其他位點進行改造的報道不多.目前，Honda等[5-6]發現了化合物1(化合物1～3的結構見圖1)是OA研究領域的一個重大突破，其具有極強的抗腫瘤活性.化合物2和化合物3等均表現出顯著增強的抗腫瘤活性，并且能夠作用于細胞內多條信號轉導通路，是迄今為止抗腫瘤活性最強的半合成三萜化合物[5-7].因此，化合物1的結構優化也成為當前的研究熱點.WIEMANN等[8]對OA的C-3位羥基和C-28位羧基進行了結構修飾，合成的氧肟酸衍生物較OA抗腫瘤活性有了顯著增強.另有研究發現[9-11]，將C-28位羧基改造成酯或酰胺，對提高OA的抗腫瘤活性有利.

圖1 化合物1～3的結構

本文結合前期OA結構改造的經驗[12-13]，將A環C-2，3位改造成酮肟基，形成新型A環結構，同時C-28位羧基進行成酯或酰胺化，設計合成了兩類共10個新型OA衍生物.合成路線見圖2.

試劑和條件：a 丙酮，瓊斯試劑，室溫 b 二甲基甲酰胺，無水碳酸鉀，溴代烷 c 叔丁醇，叔丁醇鉀，50 ℃ d 鹽酸羥胺，無水吡啶 e 二氯甲烷，草酰氯，二甲基甲酰胺，室溫 f 苯酰胺，三乙胺，室溫

1 實驗部分

1.1 化學合成

1.1.1 3-氧代-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸的制備(OA-1)

OA(0.500 g，1.10 mmol) 溶解于50 mL丙酮溶液中，冰浴條件下緩慢滴加配制的新鮮Jones 試劑(0.64 mL，5.78 mmol)，常溫反應2 h后，加入異丙醇(15 mL)，常溫反應0.5 h.水洗，無水硫酸鎂干燥，減壓抽濾，蒸發溶劑.粗品分離純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得白色固體OA-1(0.470 g，質量分數為95 %).

中間體OA-1(0.470 g，1.05 mmol) 溶解于DMF(20 mL)，加入碳酸鉀(0.3g) 和溴乙烷[n(OA-1)∶n(溴乙烷)=1∶5]，常溫反應5 h.過濾，水洗，無水硫酸鎂干燥，減壓抽濾，蒸發溶劑.粗品分離純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=50/1]，得白色固體OA-2(0.380 g，質量分數為76 %).

1.1.3 2，3-二氧代-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸乙酯的制備(OA-3)

化合物OA-2(0.380 g，0.79 mmol) 溶解于叔丁醇(30 mL)，加入叔丁醇鉀(25 mg，2.22 mmol) 和四氫呋喃(3 mL)，50 ℃水浴反應6 h.蒸發去除溶劑，先用鹽酸進行酸洗，再用食鹽水進行水洗，無水硫酸鎂干燥，減壓抽濾，蒸發溶劑.粗品分離純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=50/1]，得白色固體OA-3(0.440 g，質量分數為89 %).

1.1.4 2，3-二酮肟-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸乙酯的制備(Ⅰ1)

化合物OA-3(0.440 g，0.70 mmol) 溶解于無水吡啶(20 mL)，加入鹽酸羥胺(0.9 g，13.00 mmol)，120 ℃油浴回流1 h.冷卻到室溫時，有白色固體析出，然后過濾、干燥.粗品分離純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得白色固體Ⅰ1(0.320 g，質量分數為86 %).

制備化合物Ⅰ2～Ⅰ5時替換為不同的鹵代烷，按上述方法操作.

1.1.5 3-氧代-齊墩果烷型-12-烯-28-酰氯的制備(OA-4)

中間體OA-1(0.470 g，1.05 mmol) 溶解于二氯甲烷(25 mL)，加入草酰氯(0.85 mL，1 mmol)和DMF(20 mL)，常溫反應4 h.蒸發去除溶劑，加入適量環己烷移除殘余草酰氯，減壓脫溶，得淡黃色固體OA-4(0.370 g，質量分數為74 %)，直接進入下一步反應.

利用CPTU實測資料來估算土層重度，Larsson和Mulabdic（1991）通過對在瑞士、挪威和英國的試驗資料的分析，提出采用凈錐尖阻力（qt-σvo）和孔壓參數比Bq對土的密度或重度進行估計。

1.1.6 3-氧代-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制備(OA-5)

化合物OA-4(0.370 g，0.76 mmol) 溶解于二氯甲烷中，加入苯酰胺[n(OA-4)∶n(苯酰胺)=1∶1.2]和三乙胺(TEA，0.6 mL)，常溫下反應過夜，蒸發去除溶劑.粗品經硅膠柱色譜分離、純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=60/1]，得淡黃色固體OA-5(0.280 g，質量分數為69 %).

1.1.7 2，3-二氧代-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制備(OA-6)

化合物OA-5(0.280 g，0.55 mmol) 溶解于叔丁醇(30 mL)，加入叔丁醇鉀(25 mg，2.22 mmol) 和四氫呋喃(3 mL)，50 ℃水浴反應6 h.蒸發去除溶劑，加入適量乙酸乙酯溶液溶解，先用鹽酸進行酸洗，再用食鹽水進行沖洗，最后用無水硫酸鎂干燥、過濾、蒸發去除溶劑.粗品經硅膠柱色譜分離、純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=60/1]，得淡黃色固體OA-6(0.240 g，質量分數為85 %).

1.1.8 2，3-二酮肟-齊墩果烷型-12-烯-28-酰-苯胺的制備(Ⅱ1)

化合物OA-6(0.240 g，0.40 mmol) 溶解于無水吡啶中(20 mL)，加入鹽酸羥胺(0.6 g，8.63 mmol)，120 ℃油浴回流1 h.冷卻到室溫時，有白色固體析出，然后過濾、干燥.粗品經硅膠柱色譜分離、純化[V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]，得淡黃色固體Ⅱ1(0.200 g，質量分數為84 %).

制備化合物 Ⅱ2～Ⅱ5時替換為不同的胺類，按上述方法操作.

1.2 初步體外活性測試

以吉非替尼和阿霉素為陽性對照物，采用MTT法對合成的目標化合物進行體外抗腫瘤活性測試.選用人胃癌SGC7901和人肺癌A549細胞為靶細胞.在96孔培養板內培養對數生長期的腫瘤細胞，每100 μL約4 000個細胞.將其置于37 ℃、體積分數為5 %的CO2全濕條件培養24 h.將含有不同濃度的合成的10個新型衍生物加入到給藥組，設置3個平行孔.陰性對照組加有等體積的溶劑(無血清的RPMI-1640培養基)，并設只加RPMI-1640培養基的空白對照組，置37 ℃、體積分數為5 %的CO2溫箱中培養72 h，丟棄培養液，每孔加入MTT溶液50 μL，37 ℃ 下孵育4 h，丟棄上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，輕度振蕩溶解甲臜顆粒.在酶標儀波長490 nm條件下測定光密度值(OD)，計算所測化合物對腫瘤細胞的抑制率和IC50值.實驗重復3次，結果取平均值.

2 結果與討論

2.1 目標化合物的確證

目標化合物結構經1H-NMR、MS等確證，數據見表1和表2.

表1 目標化合物的質譜和元素分析數據

表2 目標化合物的氫譜數據

所有目標化合物結構經1H-NMR、MS等確證，為10個未見報道的新型齊墩果酸衍生物.

2.2 生物活性評價

采用MTT法對目標化合物進行初步的體外抗腫瘤活性測試.選用吉非替尼和多柔比星為陽性對照物，人胃癌細胞SGC7901和人肺癌細胞A549為靶細胞，實驗結果見表3.

由表3中分析可知：在一定濃度下目標化合物對SGC7901、A549均具有一定抑制作用，且活性強于母體OA.C-28位羧基成酯時，活性整體呈上升趨勢，表明隨著酯鏈的延長活性更佳；C-28位羧基成酰胺時，活性普遍強于成酯類；其中化合物Ⅱ5表現出良好的抗腫瘤活性，IC50值分別為10.76和13.28，與吉非替尼活性相當，可進一步研究.

3 結 論

以OA為先導化合物，對A環及C-28位羧基進行結構改造，設計合成了兩類新型OA衍生物.經體外藥理活性測試，C-28位羧基成酯或成酰胺，均能顯著提高抗腫瘤活性，表明OA的活性位點主要來自于A環，這與Honda等發現化合物1的觀點一致，說明對A環的結構改造至關重要.同時化合物Ⅱ5表現出較強的抑制活性，可能與苯環上帶有吸電子基團有關，說明在C-28位連接帶有強吸電子基團的結構更能提高抗腫瘤的活性，這也是本文的下一步研究方向.綜上所述，本研究結果對進一步OA結構修飾有一定的參考意義.