內江豬保種場種母豬肺炎支原體檢測

陳謙，呂云龍，林芳卉

（1.內江市種豬場，四川 內江 641007；2.西南大學動物科學學院，重慶 榮昌 402460）

豬支原體肺炎（MPS），是由豬肺炎支原體感染豬引起的一種呼吸道傳染病。臨床上主要表現為咳嗽、被毛粗亂、呼吸加快、生長發育受阻、飼料轉化率低等。特征性病理變化為豬肺部出現“對稱性蝦肉樣變”。單純豬肺炎支原體感染的死亡率一般不高，但通過抑制肺部免疫可以引發潛伏性、慢性支氣管肺炎，繼而被細菌、病毒等感染，在很大程度上促進了豬呼吸道疾病綜合癥的發生，給規模化養豬場的豬群帶來嚴重的危害［1］。因此，控制豬場豬支原體感染是保證豬群健康的重要一環。

為了解內江豬保種場種母豬肺炎支原體的感染情況，本試驗采集內江豬保種場未免疫種母豬的血液95 份，并分離血清，用ELISA 方法檢測豬肺炎支原體抗體；同時采集未免疫種母豬的鼻拭子95 份，提取豬肺炎支原體DNA，進行豬肺炎支原體PCR擴增，了解保種場種母豬肺炎支原體的帶菌情況［2-8］。根據兩種檢測結果，結合繁殖性能情況擬定淘汰計劃，為保種場豬肺炎支原體的防制提供科學依據。

1 材料

1.1 被檢鼻拭子 隨機選擇未免疫的種母豬，用PBS 潤濕無菌棉簽，將棉簽以45°左右插入豬鼻孔，輕輕旋轉，刺激豬打噴嚏，2個噴嚏過后，輕輕拔出棉簽，放入1.5 mL裝有PBS的離心管中，密閉冰袋保存，置-20 ℃冰箱中備檢［9］。

1.2 被檢血清 隨機選擇未免疫的種母豬，前腔靜脈采血3～5 mL，室溫靜置，待血清析出后，離心管3 000 r/min 離心10 min 分離血清，取上清液于-20 ℃保存待檢。

2 試驗方法

2.1 鼻拭子PCR檢測

2.1.1 引物合成 采用李石等［10］報道的豬肺炎支原體P97基因，合成引物，片段大小為1 173 bp，引物序列分別如下：

上游引物：5′-TTGGTCTAACTGTCGGACTT-3′；下游引物：5′-CGCTTGCTGCATCTAGGCTATAT-3′。

送上海生工生物公司進行合成。

2.1.2 豬肺炎支原體DNA 的提取 嚴格按寶生生物工程（大連）有限公司生產的細菌基因組提取試劑盒說明書進行。

2.1.3 PCR反應體系及條件 豬肺炎支原體P97基因PCR擴增反應體系及條件見表1。

表1 PCR反應體系及條件 μL

2.1.4 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳 5倍TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH 值8.0。使用時將其稀釋10 倍至0.5×TBE 緩沖液，可同時作為電泳及制膠用的緩沖液。根據制膠量及凝膠濃度標準制膠，取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在110 V，電流在40 mA以上。當條帶移動到距凝膠前沿約2 cm 時（耗時約40 min），停止電泳，在凝膠成像系統中拍照并觀察結果。

2.2 血清ELISA抗體檢測 操作方法、結果判定嚴格按上海酶聯生物科技有限公司生產的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒進行。

3 試驗結果

3.1 種母豬鼻拭子豬肺炎支原體P97 PCR擴增結果 通過PCR 擴增，得到與P97 大小相符的核酸片段，為1 173 bp。在95份鼻拭子中，有5份為陽性，陽性率為5.26%。詳見表2。

表2 種母豬肺炎支原體PCR及ELISA抗體檢測結果

3.2 種母豬肺炎支原體血清ELISA 抗體檢測結果 用ELISA 方法檢測95 份未免疫種母豬的肺炎支原體血清抗體，結果有40 份陽性，55 份陰性，陽性率為42.10%。詳細結果見表2。

4 分析與討論

4.1 根據豬肺炎支原體P97 基因保守序列設計的引物對豬肺炎支原體進行診斷，克服了豬肺炎支原體培養困難、血清學檢測中豬肺炎支原體與豬鼻支原體易發生交叉反應的缺點，可見通過P97基因PCR診斷豬肺炎支原體是一種十分可靠的方法。本試驗采用PCR 法檢測了內江豬保種場未免疫母豬的鼻拭子95 份，結果顯示鼻拭子PCR檢測豬肺炎支原體的陽性率為5.26%。有報道用PCR方法對303份鼻拭子樣品進行豬肺炎支原體檢測，結果陽性率為12.5%。本試驗與上述報道相比，陽性檢出率較低，其原因可能是隨著豬肺炎支原體感染日期的增加，感染豬不排菌或者豬鼻排出的豬肺炎支原體達不到檢測的量。武昱孜等［11］用PCR 檢測方法對72 份支氣管肺泡灌洗液進行了豬肺炎支原體檢測，陽性率為58.33%；馬曉迪等［12］用PCR 檢測方法對550 份支氣管肺泡灌洗液進行了豬肺炎支原體檢測，陽性率為50%。從上述報道結果看，豬肺炎支原體在支氣管肺泡灌洗液中的檢出率均比鼻拭子中的高。由此可以看出，雖然鼻拭子PCR在豬早期感染時具有一定作用，但是受制于感染日期和采樣部位，可能導致漏診。因此，鼻拭子PCR 用于豬肺炎支原體診斷時應與其他方法結合進行。

4.2 本試驗采用ELISA 對95 份未免疫種母豬的血清進行抗體檢測，結果顯示感染率為42.1%。楊莉等［13］對貴州省六個地區13 327 份樣品進行豬肺炎支原體血清學調查，結果感染率為30%；師麗敏等［14］對海南省海口市部分地區的212份血清樣品進行豬肺炎支原體抗體檢測，結果陽性率為50.6%；李石等［10］對新疆北疆地區456 份樣品進行豬肺炎支原體血清學調查，結果感染率為50.44%。上述報道與本試驗結果基本一致，說明內江豬保種場的種母豬感染肺炎支原體比較嚴重，需進一步采取防控措施。

4.3 本試驗中鼻拭子PCR檢測陽性率為5.26%，血清ELISA 抗體檢測陽性率為42.1%，兩種檢測方法的結果差異較大，ELISA 抗體檢測陽性率明顯高于PCR，究其原因可能與豬感染肺炎支原體后隨著抗體的產生，機體內肺炎支原體逐漸被清除有關；另外一個原因是隨著感染日期的延長，豬肺炎支原體從鼻咽部遷移到支氣管乃至肺泡內，因此鼻咽拭子的檢出率較低。這也與有關文獻報道的豬肺炎支原體在支氣管肺泡灌洗液中檢出率最高相符合［15-16］。