基于橋接DNA的實時熒光定量PCR高靈敏檢測沙丁胺醇

趙領(lǐng)娣，孫鐵強，劉文濤，賀鴻偉，董博偉，張迎春，秦天悅，寧保安，李雙，彭媛，韓殿鵬，崔建升，高志賢，*

（1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050）

沙丁胺醇（salbutamol，SAL），是一種短效 β-2 腎上腺素能受體激動劑，最初用于緩解哮喘和慢性阻塞性肺病等疾病中的支氣管痙攣。然而，當(dāng)使用劑量為治療劑量的5倍～10倍時，沙丁胺醇可以通過減少脂肪沉積和增強蛋白質(zhì)含量來提高生長速率和提高飼喂效率；因此，它在養(yǎng)殖業(yè)和其他相關(guān)農(nóng)業(yè)中被許多商人非法使用以增加瘦肉產(chǎn)量，并且在動物體內(nèi)富集[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)β-2-腎上腺素能受體激動劑如沙丁胺醇的攝入，會增加自閉癥的風(fēng)險[4]；導(dǎo)致肌纖維肥大，甚至在一定劑量下導(dǎo)致肌肉細(xì)胞死亡[5]；沙丁胺醇的微量吸入會降低血氧飽和度[6]等。農(nóng)業(yè)部公告明確指出沙丁胺醇是一種禁用藥物，不應(yīng)該在食物或水中檢出[7]。因此建立對沙丁胺醇的超靈敏檢測技術(shù)尤為重要。

針對沙丁胺醇的檢測，目前已發(fā)展多種基于免疫學(xué)的檢測方法。基于CdSe量子點（quantum Dot，QD）電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）競爭性免疫測定法[8]，基于免疫磁珠和氧化石墨烯/金納米粒子混合基質(zhì)的表面增強拉曼技術(shù)[9]，基于三聚氰胺探針功能化的金納米粒子比色檢測方法[10]，基于碳納米管的電化學(xué)檢測方法，并通過差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）測量評估該沙丁胺醇的電化學(xué)傳感性能[11]。基于局部表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）傳感的無標(biāo)記無試劑免疫法[12]等等。然而，這些檢測方法靈敏度不足或設(shè)計復(fù)雜，限制了它們的開發(fā)和廣泛應(yīng)用。

DNA分子由于其強大的序列可編程性和準(zhǔn)確的分子識別能力而被廣泛用于生物傳感[13]。目前有許多信號放大策略來開發(fā)基于DNA的敏感生物傳感器[14]。其中20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）已成為一種成熟的擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因檢測。在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，同步實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增和定量，具有高靈敏性，特異性[15-16]。在DNA walker和折紙技術(shù)等不同的生物傳感策略中，必須設(shè)計獨特的DNA分子序列以產(chǎn)生獨特的分子結(jié)構(gòu)[17]。在本研究中，利用基于橋接DNA的鄰近連接技術(shù)的普通ssDNA實現(xiàn)信號放大。

Cheng-ting Tsai等[18]利用抗體的雙價識別抗原的能力，設(shè)計基于抗原抗體特異性識別和連接酶特異性識別的原理，從而構(gòu)建低背景值的高效DNA信號放大傳感器。這些傳感器利用兩個DNA連接的抗原分子與同一抗體分子結(jié)合，誘導(dǎo)短DNA結(jié)構(gòu)域的互補雜交，形成全長擴(kuò)增子，通過擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行信號放大。在性質(zhì)上與鄰近連接實驗類似，通過抗體的多價結(jié)合驅(qū)動抗原DNA偶聯(lián)物的凝集，抗原可以是小分子[19]、蛋白質(zhì)[18]、外泌體[20]等任何可以與DNA做連接的物質(zhì)。該方法不需要復(fù)雜的DNA設(shè)計，在顯著降低其背景值的同時具有較高的靈敏度。

本研究結(jié)合免疫磁珠、橋接DNA-DNA連接酶介導(dǎo)的DNA融合技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏檢測沙丁胺醇的方法，該檢測方法有效的降低背景值，提高了靈敏度，在環(huán)境、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

TGL-16C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-11型電泳儀：北京六一儀器廠；IQ350凝膠成像系統(tǒng)：美國GE公司；OSE-96干式恒溫金屬浴：北京天根生化科技有限公司；MS3 Basic渦旋振蕩器：德國IKA公司；GNP-9050BS恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MyGo Pro實時熒光定量PCR儀：IT-IS Life Science Ltd。

1.1.2 主要試劑

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（SAL）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國 Sigma-Aldrich 公司；沙丁胺醇多克隆抗體（B180517）：北京博爾西科技有限公司；Dynabeads抗體偶聯(lián)試劑盒：美國Thermo Fisher Scientific公司；磁珠封閉液：百邁格生物公司；PBST緩沖液（含0.05%Tween 20）：北京索萊寶生物科技有限公司；DNA連接酶（A8101）：美國Epicentre生物技術(shù)公司；qPCR kit：上海星漢生物科技有限公司；超純水（＞18.0 MΩcm）。所有DNA樣品均由上海生工生物工程有限公司合成（經(jīng)HPLC純化），核酸序列見表1。

表1 試驗所用核酸序列Table 1 DNA sequences used in this study

1.2 方法

該方法首先將磁珠偶聯(lián)抗體形成免疫磁珠IAb。同時設(shè)計了一對寡核苷酸探針DNA1、DNA2，每個寡核苷酸鏈由40 nt堿基組成。使用SMCC連接方法，將SAL-BSA與3'SH游離末端DNA寡核苷酸（DNA 1）偶聯(lián)以制備SAL探針1與5'SH游離末端DNA寡核苷酸（DNA 2）偶聯(lián)制備SAL探針2，兩個寡核苷酸探針同時與同一抗體分子結(jié)合，使兩個探針進(jìn)入相同的復(fù)合物分子，顯著增加探針兩個短序列的局部有效濃度。然后，這兩個短序列經(jīng)過與橋接DNA（bridge）堿基互補配對、在特異性DNA連接酶的作用下形成80 nt全長擴(kuò)增子，即AbD的橋聯(lián)結(jié)構(gòu)。通過磁分離將AbD結(jié)構(gòu)分離，進(jìn)一步降低背景值。之后采用實時熒光定量PCR實現(xiàn)信號放大并進(jìn)行檢測。

1.2.1 免疫磁珠的制備。

準(zhǔn)確稱取5 mg的M270磁珠粉末（磁珠直徑2.8 μm）放入1.5 mL離心管內(nèi)，使用C1溶液洗滌后加入 20 μL（2.3 mg/mL）的兔多抗，再加入 230 μL 的 C1溶液和C2溶液250 μL至總體積500 μL。置于垂直混旋儀中37℃孵育20 h。加入緩沖液多次洗脫后加入500磁珠封閉液室溫（25℃）4 h后重懸在500 μL緩沖體系中，在4℃下儲存供下一步使用。

1.2.2 DM探針的制備

取 60 μL sulfo-SMCC的 HEPES緩沖液稀釋（7.5 nmol/L），加入20 μL 沙丁胺醇-OVA（10 mg/mL 約222 nmol/L），避光反應(yīng) 30 min。加 20 μL HS-DNA（10 μmol/L）溶液，4℃過夜。使用30 kDa超濾管10 000 r/min 離心 1 次，2 min/次。

1.2.3 檢測方法的建立

取免疫磁珠儲備溶液、探針1、2各5 μL體積加入一個1.5 mL離心管中，加入PBST至50 μL，其中探針濃度為10 nmol/L，將混合物在37℃孵育30 min，并用100 μL 0.05%PBST洗滌兩次。重懸到120 μL含有連接酶、橋接DNA的連接緩沖體系中（20 mmol/L Tris，25 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，7.5 mmol/L DTT，0.5 μmol/L NAD，0.021 U/μL ligase，100 nmol/L bridge oligo，0.01%TritonX-100，pH 8.0），在 30℃下孵育15 min。并用130 μL 0.05%PBST洗滌兩次。磁分離，PBST洗滌2次3 min/次，磁分離1 min。重懸在50 μL體系中作為模板。在10 μL qPCR Master mix中加入上下游引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，同時加入 5 μL 模板，加入ddH2O制備20 μL體系。qPCR系統(tǒng)程序設(shè)置（95℃：300 s；95 ℃：10 s；60 ℃：30 s；72 ℃：30 s；45 T）。

1.2.4 特異性

應(yīng)用濃度為1 ng/mL的沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、苯氧丙酚胺、克侖特羅對1.2.3建立的方法進(jìn)行特異性檢驗。

1.2.5 模擬實際樣品檢測

將沙丁胺醇按500、5 000、10 000 pg/mL依次分別加入到自來水、人工尿液中，應(yīng)用1.2.3建立的方法進(jìn)行回收檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 可行性分析

成功偶聯(lián)抗體與磁珠、抗原與DNA之后首先對試驗的可行性進(jìn)行了驗證，加入免疫磁珠與只加入磁珠的對照組相比，前者具有更低的Ct值，與對照組差異明顯，證明該方案可以通過加入不同濃度的沙丁胺醇競爭結(jié)合免疫磁珠而產(chǎn)生不同的Ct值實現(xiàn)對沙丁胺醇的定量檢測。

2.2 條件優(yōu)化

為了實現(xiàn)用于小分子檢測的生物傳感器的最佳性能，優(yōu)化了免疫磁珠濃度及橋接長度。兩條連接小分子的寡核苷酸鏈在免疫磁珠的作用下與bridge雜交是AbD的獨特之處。首先對bridge的連接作用進(jìn)行了測試。設(shè)計了 20、18、16、14、12nt bridge 5 個優(yōu)化長度，見圖1。

圖1 不同橋接長度DNA自誘導(dǎo)連接的能力測定Fig.1 Determination of the ability of DNA to self-induced ligation of different bridging lengths

選用不同長度bridge，在高濃度DNA探針存在并且不加IAb時，可以通過自身高碰撞率，分子間親和力結(jié)合在一起，bridge序列越長，連接作用越大，進(jìn)行qPCR的模板越多，產(chǎn)生的Ct值越小。16、14、12nt的長度下產(chǎn)生的Ct值接近0nt（背景對照）產(chǎn)生的Ct值，表明bridge長度在16nt時進(jìn)入平臺期，連接能力幾乎為零。我們使用20、18、16nt序列長度做進(jìn)一步優(yōu)化，將免疫磁珠調(diào)整為能形成AbD的橋聯(lián)結(jié)構(gòu)的最適比例，防止DNA高濃度后的自連接。一個抗體可能同時連接兩個5'端修飾小分子DNA、或兩個3'端修飾小分子DNA，這都是不希望出現(xiàn)的結(jié)合，不能形成AbD結(jié)構(gòu)。優(yōu)化抗體濃度及反應(yīng)體系的大小避免這種潛在問題的出現(xiàn)。

免疫磁珠濃度梯度依次為 6、60、600、6 000 ng/mL及控制組。同一抗體濃度下加入不同長度的bridge，觀察Ct值變化，見如圖2。

圖2 在不同橋接長度下不同免疫磁珠濃度的Ct值響應(yīng)Fig.2 The Ct value response for different immunomagnetic bead concentrations at different bridge lengths

更長的bridge有更高的結(jié)合效率，Ct值越小，表明增加bridge長度增強了所需AbD的形成。如果莖序列太長，它們可以在不存在與靶標(biāo)結(jié)合的抗體的情況下自發(fā)地雜交在一起，這種分子間雜交會降低檢測靈敏度。抗原抗體之間存在一個最佳結(jié)合濃度，抗原抗體任何一個濃度增大，都會抑制二者之間的結(jié)合。抗體濃度為60 ng/mL時，產(chǎn)生的Ct值最小，效果最佳。綜上，該體系的最佳反應(yīng)條件：抗體濃度60 ng/mL、bridge 長度 20nt。

2.3 方法性能

利用本方法檢測不同濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品。將具有不同濃度的SAL添加到反應(yīng)系統(tǒng)中以確定在優(yōu)化條件下的檢測范圍和靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 檢測不同濃度沙丁胺醇工作曲線Fig.3 Linear calibration curves for detection of RT in different concentration

隨著小分子濃度的增加，傳感器的Ct值逐漸增大。基于Ct值的響應(yīng)，獲得具有在1.0×10-2ng/mL～1.0×103ng/mL范圍內(nèi)的良好線性關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，線性方程為 y=0.826lg（x）+24.29，相關(guān)系數(shù)（R2）為 0.999 2。在與分析實際樣品完全相同的條件下，做不加入被測組分的重復(fù)測定即空白試驗。根據(jù)空白值的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算SAL的檢出限（LOD）為1.2×10-2ng/mL。該方法具有檢測范圍寬、操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點。

2.4 特異性檢測

為了測試該方法的特異性，選擇沙丁胺醇的結(jié)構(gòu)、功能類似物萊克多巴胺、特布他林、苯氧丙酚胺、克侖特羅作為對照物。其特異性檢測結(jié)果見圖4。

2.5 樣品加標(biāo)模擬檢測

圖4 方法的選擇性Fig.4 Specificity test of this method

采用本方法檢測自來水及人工尿液樣品中的沙丁胺醇。自來水及人工尿液分別首先在10 000 r/min下離心5 min，取上清液，然后加入一定濃度的沙丁胺醇進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

表2 自來水和人工尿液中沙丁胺醇加標(biāo)回收測定結(jié)果（n=3）Table 2 Recoveries of RT in tap water and artificial urine samples（n=3）

加標(biāo)回收率在87.1%～111.7%之間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差/計算結(jié)果的算術(shù)平均值得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5.1%，表明本方法靈敏度較高，準(zhǔn)確性較好，可用于自來水和尿液實際中沙丁胺醇的的檢測。

3 結(jié)論

構(gòu)建了一種基于免疫磁珠、橋接DNA-DNA連接酶介導(dǎo)的DNA融合技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏檢測沙丁胺醇的方法，通過抗體特異性識別兩個鄰位連接探針在橋接DNA的作用下，形成全長擴(kuò)增子，以此為模板擴(kuò)增實現(xiàn)信號放大，沙丁胺醇的檢出限為1.2×10-2ng/mL，用于自來水及尿液中沙丁胺醇的檢測，效果良好。本方法操作簡單，不需要復(fù)雜的DNA設(shè)計；線性范圍寬、靈敏度高。本方法適用于任何可以與DNA連接的抗原物質(zhì)，對于其它目標(biāo)物的檢測具有一定的借鑒和參考價值。