微小RNA-216a在急性胰腺炎并發肺損傷患者中的表達水平及其對內皮細胞通透性的影響

朱惠云 宋英曉 孔祥毓 杜奕奇

海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200433

AP并發急性肺損傷(acute lung injury, ALI)發病急驟，病情兇險，病死率居高不下，占AP總體病死率的70%[1-2]。外泌體是細胞分泌的一種微小囊泡，可包裹蛋白質或RNA等生物信息分子，參與體內重要的物質運輸。既往動物實驗研究發現，miR-216a在AP大鼠血漿中顯著高表達，或可作為AP的標志物[3]，但目前尚無miR-216a與AP并發ALI相關的研究。內皮細胞通透性的改變是ALI發生發展的中心環節[4]，本研究旨在檢測miR-216a在AP并發ALI患者血漿及其外泌體中的表達水平，以具有干細胞潛能的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)作為體外內皮細胞模型，檢測miR-216a對內皮細胞通透性的影響，從而了解miR-216a參與AP并發ALI發生的具體機制。

材料與方法

一、研究對象

收集2015年12月至2016年3月間海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科收治的40例AP患者，按是否并發ALI將患者分為AP并發ALI組(AP-ALI組，13例)和AP不并發ALI組(AP組，27例)。以8 名健康志愿者作為對照組。AP診斷符合2012年亞特蘭大AP診斷標準[2]。ALI的診斷標準：(1)存在如AP等高危因素；(2)起病急驟，出現呼吸頻率加快伴或不伴呼吸窘迫；(3)低氧血癥，動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg (1 mm Hg=0.133 kPa)；(4)X線檢查可見雙肺浸潤影；(5)肺毛細血管楔壓≤18 mmHg，除外心源性肺水腫[5]。本研究獲醫院倫理委員會審批(CHEC2015-067)，所有患者及志愿者均簽署相關知情同意書。

二、血漿及其外泌體的采集和RNA的抽提

收集AP患者入院24 h內的新鮮外周血3～5 ml于EDTA抗凝管中，輕輕混均后置1 000 g離心10 min。收集上層血漿，-80℃凍存。健康志愿者血漿采集方法同上。使用TRI Reagent BD(Ambion，美國)抽提血漿RNA。采用外泌體抽提試劑盒(QIAGEN，德國)提取血漿中的外泌體，按照試劑盒說明書操作。取2 μl提取的外泌體樣本滴于經過親水化處理的載網上，干燥后用甲酸鈾染色1min，吸干并置于烤燈下烘烤10min后置電鏡觀察和鑒定。同上法抽提外泌體RNA。

三、miR-216a檢測

采用RT-PCR法檢測血漿及外泌體miR-216a的表達。使用TaqManTMmicroRNA逆轉錄試劑盒(Thermo Fisher，美國)先逆轉錄成cDNA，再使用TaqManTM通用PCR主混合料在LightCycler 480熱循環機 (Roche，德國)上進行qRT-PCR擴增，以miR-39(QIAGEN，德國)作為外源性參照。miR-216a引物序列為3′UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-5′，PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s；60℃、60 s，40個循環。通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值，將45-Ct=45-(CtmiR-216a-CtmiR-39)作為描述miR-216a相對表達量的參數。CtmiR-216a-CtmiR-39值>45的樣本統一按45進行計算。實驗重復3次，取均值。

四、內皮細胞通透性的測量

HUVEC細胞購自美國ATCC細胞庫，復蘇后置于10%胎牛血清、雙抗、碳源的DMEM高糖培養液中培養、傳代。使用Lipofectamine?2000(Thermo Fisher，美國)將anti-miR-216a轉染入HUVEC細胞，構建miR-216a低表達細胞株。

將AP-ALI患者的血漿外泌體分別與HUVEC(AP-ALI-HUVEC組)、miR-216a低表達HUVEC(AP-ALI-anti-miR-216a HUVEC組)共培養24 h，以未處理的HUVEC細胞作為對照組。取對數生長期內皮細胞，以每孔0.2×104個細胞接種至Transwell細胞小室(Corning costar，美國)上室，下室加培養液，培養至細胞融合度接近100%時，將Millicell ERS-2上皮伏特歐姆計的電極片短端浸入上室內部培養液內，長端浸入下室培養基內，且與培養板成90°垂直，讀取并記錄跨內皮細胞電阻值(trans-endothelium electrical resistant, TEER)，電阻值低表示內皮細胞的通透性高。每組設置2個小室，每個小室重復測3次，取均值。

五、統計學處理

結 果

一、臨床基本信息

AP-ALI組與AP組患者的性別比、年齡、病因、血淀粉酶水平的差異均無統計學意義，但AP-ALI組患者血肌酐和尿素氮水平顯著高于AP組，差異均有統計學意義(表1)。

表1 40例急性胰腺炎患者一般資料

二、對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿miR-216a水平

對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿miR-216a水平分別為5.37±1.54、11.08±1.60、14.45±1.64，AP-ALI組顯著高于AP組，AP組又顯著高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為6.15、9.11，P值均<0.01)。

三、對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿外泌體 miR-216a水平

電鏡下觀察血漿外泌體為大小50～90 nm的杯狀膜泡(圖1)。對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿外泌體中miR-216a水平分別為5.01±0.79、10.86±1.31、14.03±1.58，AP-ALI組顯著高于AP組，AP組又顯著高于對照組，差異均有統計學意義(t值分別為6.25、7.98，P值均<0.01)。

圖1 AP-ALI患者血漿外泌體的形態(透視電鏡，×10 000倍)

四、miR-216a增加內皮細胞通透性

以對照組的電阻值為1，AP-ALI-HUVEC組、AP-ALI-anti-miR-216a HUVEC組的電阻比值分別為0.74±0.04、1.02±0.08，AP-ALI-HUVEC組顯著低于其他兩組，差異均有統計學意義(t值分別為5.73、5.21，P值均<0.05)，提示AP-ALI患者血漿外泌體通過運輸miR-216a增加HUVEC通透性。

討 論

AP合并ALI的診斷通常基于臨床表現、實驗室檢查和影像學檢查技術，目前尚缺乏能夠早期高效預判AP合并ALI的標志物[6-8]。miR-216a與各種疾病特別是胰腺相關疾病密切相關[9-13]。與正常胰腺組織相比，miR-216a在胰腺導管腺癌中下調200倍以上，在慢性胰腺炎中miR-216a表達無明顯變化，在胰腺星狀細胞轉化為肌成纖維細胞時miR-216a表達下調[14]。此外，miR-216a還與胰腺導管腺癌細胞遷移、侵襲、上皮間充質轉化相關。本課題組既往研究結果顯示，miR-216a可作為AP大鼠的標志物，其靈敏度和特異度均高于血清淀粉酶[3]。本研究結果表明，AP-ALI組患者血漿miR-216a水平顯著高于AP組，AP組血漿miR-216a水平又顯著高于健康志愿者。為進一步探討miR-216a以何種形式存在于血漿中，本研究抽提血漿中的外泌體并檢測miR-216a的表達水平，結果顯示AP-ALI組患者血漿外泌體內miR-216a水平顯著高于AP組，AP組血漿外泌體miR-216a水平又顯著高于健康志愿者，間接提示miR-216a以外泌體形式存在于血漿中。

內皮細胞通透性的改變是ALI發病的中心環節。TEER是衡量內皮細胞通透性的常用指標。有研究報道miR-216a可能是急性呼吸窘迫綜合征的一個保護因素，可通過JAK2/STAT3/NF-κB通路緩解脂多糖誘導的炎性損傷[15]。但在miR-216a與AP的相關研究中認為，miR-216a是AP發生發展的危險因素。miR-216a可通過靶向作用于PTEN和smad7，調節PI3K/AKT/TGF-β通路，誘導AP的發生[16]。細胞間緊密連接蛋白(如ZO-1、Occludin等)的表達改變可直接影響細胞通透性[17]。為探討miR-216a是否參與調節內皮細胞的通透性，本研究以HUVEC細胞作為研究對象，將anti-miR-216a 轉染入HUVEC細胞，與AP-ALI患者血漿外泌體共培養。另將未轉染anti-miR-216a的HUVEC細胞與AP-ALI患者血漿外泌體共培養，結果發現與AP-ALI患者血漿外泌體共培養后的HUVEC細胞通透性顯著高于對照組，而與AP-ALI患者血漿外泌體共培養的轉染anti-miR-216a的HUVEC細胞通透性與對照組差異無統計學意義，表明miR-216a可增加內皮細胞通透性，可能與肺損傷的發生相關。miR-216a是否通過改變緊密連接蛋白的表達增加內皮細胞通透性，及其具體調節機制有待進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突