微小RNA-21對胰腺癌PANC1細胞侵襲、遷移和凋亡的影響及其作用機制

金賽燕 章惠萍 任寧寧

杭州市腫瘤醫院檢驗科，杭州 310002

微小RNA(microRNA, miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細胞中非編碼的長19～24 nt的單鏈小分子RNA。目前研究表明，多種miRNA參于腫瘤的發生、發展及轉移，可作為腫瘤治療的有效靶點。miRNA-21(miR-21)是一類原癌基因，在多種腫瘤組織中均有表達，其表達升高與胰腺癌患者的不良預后以及化療抵抗密切相關[1-2]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)屬于一種腫瘤抑制基因，是重要的抗腫瘤治療靶點。報道顯示，PDCD4參與細胞凋亡，調節多種信號轉導通路，可作為腫瘤抑制劑治療惡性腫瘤[3]。Benjamind等[4]研究結果顯示，向卵母細胞注射miR-21模擬物可降低PDCD4表達，但miR-21對胰腺癌細胞PDCD4表達的影響少有報道。本研究旨在觀察miR-21對胰腺癌PANC1細胞侵襲、遷移及凋亡的影響，探討其分子機制，為胰腺癌臨床靶向治療提供理論依據。

材料與方法

一、實驗材料

人胰腺癌PANC1細胞系購自杭州仟諾生物科技有限公司。MTT、Transwell試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。抗磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、survivin、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9一抗和二抗均購自美國Proteintech公司，抗PDCD4一抗購自美國Invitrogen公司。

二、方法

1．重組質粒構建及細胞分組：miR-21序列由上海生工生物工程技術服務有限公司根據質粒特點進行引物設計，引入SacⅠ酶切位點。miR-21引物序列：正向引物5′-AGCTCAAAAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，反向引物5′-CACCTAGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTTTG-3′。正反鏈混合后加退火緩沖液置95℃反應4 min，冷卻至室溫，形成雙鏈。同時制備靶向miR-21的小干擾RNA(siRNA-miR-21)。采用Eco31Ⅰ酶切將雙鏈miR-21及siRNA-miR-21分別插入質粒pGenesil-1，重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，平皿接種培養24 h后挑選單克隆菌落，接種于含30 μg/ml Kana的LB培養液，置37℃振蕩培養過夜。取少量大腸桿菌懸液抽提重組質粒，使用SacⅠ酶切法鑒定重組質粒是否成功。重組質粒鑒定由大連寶生物工程有限公司完成。

人胰腺癌PANC1細胞常規培養、傳代。取對數生長期細胞，待培養至70%融合狀態時用無血清DMEM培養過夜。采用脂質體2000將插入miR-21及siRNA-miR-21的重組質粒分別轉染PANC1細胞，建立miR-21過表達細胞株(過表達組)和miR-21沉默細胞株(沉默組)，以轉染空質粒組為空白組，按LipofectamineTM2000說明書操作。采用qRT-PCR法鑒定各組細胞miR-21的表達量。

2．細胞增殖檢測：采用MTT法檢測細胞增殖。取各組對數生長期PANC1細胞接種于96孔板，每孔2 000個細胞，分別培養24、48、72 h，每組每時間點設6個復孔，培養到時間點時向孔中加入20 μl 5 mg/ml的MTT，繼續培養4 h，吸去培養液，加入100 μl DMSO，振蕩5 min，上酶聯檢測儀測各孔波長490 nm處的值(A490值)。根據公式計算細胞增殖率。不同時間點增殖率=(不同時間點的A490值-0 h的A490值)/0 h的A490值×100%。實驗重復6次，取均值。

3．細胞凋亡檢測：采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。取各組對數生長期PANC1細胞，用不含四乙酸二氨基乙烷的0.25%胰酶消化5 min，用PBS洗滌、離心、重懸2次，用300目細胞過濾網過濾細胞，采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行標記染色，避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復6次，取均值。

4．細胞侵襲能力檢測：采用Transwell試劑盒檢測細胞侵襲能力。于Transwell小室的聚碳酸酯膜表面加入50 μl基底膜基質，待其凝固。取各組對數生長期PANC1細胞，用胰酶消化、PBS清洗1～2次后以10 g/L的BSA重懸細胞，調整細胞密度至1×105個/ml。取150 μl細胞懸液加入到Transwell上室，下室加細胞培養液，培養24 h后取出小室的隔膜，輕輕擦去隔膜上表面未穿膜細胞，用乙醇固定隔膜5 min，行臺盼藍染色，置倒置顯微鏡下隨機選取5個200倍視野計數穿膜細胞數。每組做6個Transwell小室，取均值。

5．細胞遷移能力檢測：采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。將各組對數生長期細胞接種到6孔板，培養到細胞融合達到90%時，使用100 μl的槍頭垂直于孔板底部劃出3條直線，間隔0.5 cm，用PBS緩沖液清洗2～3次，加含0.5%血清培養液培養24 h，置倒置顯微鏡下對劃痕前后的相應區域拍照。每組設3個復孔，重復3次。使用Image J軟件計算各組細胞遷移24 h后覆蓋的劃痕面積。

6．細胞PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達量檢測：取各組對數生長期PANC1細胞，胰酶消化、洗滌，制備成細胞懸液，采用酶聯免疫法檢測細胞PDCD4表達量，按試劑盒說明書操作。辣根過氧化物酶標記的抗PDCD 4抗體工作濃度1∶1 000，最后加底物鄰苯二胺顯色，遮光保存20 min，加入2 mol/L H2SO40.05 ml終止反應，上酶標儀上讀取各孔A450值，每個樣本設3個復孔，實驗重復2次，取均值。

取各組對數生長期PANC1細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，采取BCA法定量蛋白后取50 μg樣品常規行蛋白質印跡法檢測細胞PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達量，以GAPDH為內參。抗PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9一抗工作濃度1∶1 000，二抗工作濃度1∶5 000，最后用ECL發光，X片曝光、顯影、定影。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示目的蛋白相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、各組細胞miR-21表達量比較

空白組、過表達組和沉默組miR-21表達量分別為0.54±0.11、0.96±0.24和0.15±0.06，沉默組miR-21表達量低于空白組，過表達組miR-21表達量顯著高于空白組，差異有統計學意義(F=40.297，P=0.000)，表明miR-21過表達組和miR-21沉默組細胞系構建成功。

二、miR-21對胰腺癌細胞增殖的影響

除沉默組72 h時間點外，空白組、過表達組、沉默組細胞增殖率均隨著培養時間的延長逐漸增加；同一培養時間點，過表達組細胞增殖率顯著高于空白組，沉默組顯著低于空白組，差異均有統計學意義(表1)，表明miR-21增強癌細胞的增殖能力。

表1 3組PANC1細胞培養不同時間點增殖率比較

三、miR-21對胰腺癌細胞凋亡的影響

空白組、過表達組、沉默組細胞凋亡率均隨著培養時間的延長逐漸增高；同一培養時間點，過表達組細胞凋亡率顯著低于空白組，沉默組細胞凋亡率顯著高于空白組，差異均有統計學意義(圖1，表2)，表明miR-21抑制癌細胞的凋亡。

圖1 空白組(1A)、過表達組(1B)、沉默組(1C)培養24 h的PANC1凋亡細胞

表2 3組PANC1細胞培養不同時間點凋亡率比較

四、miR-21轉染對胰腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響

空白組、過表達組、沉默組的穿膜細胞量分別為(212.4±32.5)、(508.8±50.7)、(50.9±10.6)個/200倍視野(圖2)；細胞遷移覆蓋面積分別為(75.6±12.1)、(118.8±20.2)、(48.8±9.5)mm2/200倍視野(圖3)。過表達組均顯著高于空白組，沉默組均顯著低于空白組，差異均有統計學意義(F值分別為259.640、327.970，P值均<0.05)，表明miR-21增強癌細胞的侵襲和遷移能力。

圖2 空白組(2A)、過表達組(2B)、沉默組(2C)的穿膜細胞數(臺盼藍染色， ×200)

圖3 空白組(3A)、過表達組(3B)、沉默組(3C)的細胞24 h遷移距離(×200)

五、miR-21對PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

沉默組PDCD4、PTEN表達量顯著高于空白組，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達量顯著低于空白組；過表達組PDCD4、PTEN表達量顯著低于空白組，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達量顯著高于空白組，差異均有統計學意義(表3，圖4)，表明miR-21的表達與PDCD4、PTEN呈負相關，而與VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達呈正相關。

圖4 空白組(1)、過表達組(2)、沉默組(3)PANC1細胞相關蛋白的表達(蛋白質免疫印跡法)

表3 3組PANC1細胞相關分子蛋白表達比較

討 論

miRNA能夠調控某一特定的基因或者蛋白，對細胞的增殖、凋亡以及分化產生影響，起到原癌基因、抑癌基因的效果，miRNA調控異常會促進腫瘤的發生及轉移[5-6]。miR-21主要定位于跨膜蛋白基因編碼區域中，轉錄后對相關基因具有負調控作用。Wang等[7]報道，胰腺癌細胞促進腫瘤相關成纖維細胞miR-21表達，miR-21的過表達會加速癌細胞的侵襲，而沉默miR-21表達可抑制癌細胞的侵襲。Alemar等[8]指出，將抗miR-21的慢病毒質粒注入胰腺癌細胞株中，能抑制胰腺癌細胞的增殖能力，且呈時間依賴性，其中下調miR-21能有效地抑制胰腺癌細胞增殖。本研究結果顯示，沉默miR-21能抑制PANC1細胞增殖，與上述研究結果一致；同時沉默miR-21能促進胰腺癌PANC1細胞凋亡，抑制癌細胞的侵襲及遷移能力。

PDCD4通過抑癌基因途徑參與細胞凋亡過程，其抑癌機制為：(1)PDCD4是miR-21下游的一種靶基因，受miR-21負向調控。文獻報道，miR-21-5p可在轉錄和翻譯水平抑制PDCD4的表達，從而促進胃癌細胞的增殖能力，誘導胃癌細胞對順鉑耐藥[9-10]。王子安等[11]報道，轉染miR-21-5p抑制劑至胃癌耐藥細胞，PDCD4基因的表達上調，對順鉑的敏感性顯著升高，表明miR-21-5p能促進腫瘤細胞的耐藥。(2)miR-21通過與PDCD4 mRNA的3′非翻譯區結合，降解mRNA或抑制mRNA翻譯蛋白，參與轉錄后調節[12]。本文研究結果顯示，沉默組PDCD4表達上調，進一步佐證了miR-21對PDCD4存在靶向負調控作用，與Abdulhussain等[13]研究一致。

VEGF能促進血管內皮細胞增殖和毛細血管形成，提高微血管通透性，促進腫瘤發生和生長[14]。PTEN蛋白可抑制細胞增殖、轉移及侵襲，誘導細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，沉默組PTEN表達上調，VEGF、survivin表達下調，提示沉默miR-21能抑制survivin、VEGF表達，促進PTEN蛋白表達上調，miR-21可能通過抑制survivin對VEGF的正向調控，增強PTEN對VEGF的負向調節，進而抑制腫瘤血管產生，誘導腫瘤細胞凋亡[16]。MMPs在腫瘤惡變過程扮演重要角色，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中研究較為熱門的兩種蛋白。張小博等[17]研究認為，MMP-2酶原激活后又可激活MMP-9，促進正反饋回路形成，參與惡性腫瘤擴散。Luo等[18]、張淑紅[19]研究指出，PDCD4通過抑制轉移相關基因VEGF、MMP-9的表達從而抑制肝癌細胞活力和遷徙及侵襲能力，促進肝癌細胞凋亡。本研究結果也顯示，沉默組PDCD4表達增高，而MMP-2、MMP-9表達相應降低，提示沉默miR-21可通過增加PDCD4表達，抑制MMP-2、MMP-9表達而抑制胰腺癌細胞侵襲和遷移。

綜上所述，沉默miR-21能上調PDCD4表達，進而調控PTEN、VEGF、survivin、MMP-9、MMP-2表達，抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡。PDCD4作為miR-21的調控因子，為胰腺癌靶向治療提供新的研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突