基于TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)集識別胰腺癌相關(guān)糖尿病特征基因

王新靜 趙昕 張欣雪 曹迪 任章勇 賈利猛 郎韌 賀強(qiáng)

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽胰脾外科，北京 100020；2北京市海淀醫(yī)院普通外科，北京 100080

胰腺癌相關(guān)糖尿病(pancreatic cancer-associated diabetes mellitus, PCDM)指胰腺癌(pancreatic cancer, PC)確診前2年內(nèi)診斷的糖尿病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PC患者有68%會新發(fā)糖尿病，明顯高于肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌[2]。74%～88%伴有糖尿病的PC患者其糖尿病發(fā)生于PC確診之前的2～5年[1,3-4]。由于PCDM與PC的診斷有一定的時間關(guān)系，因此如果能夠發(fā)現(xiàn)PCDM始動基因，將有利于PC的早期診斷。本研究基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)-PC數(shù)據(jù)集mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法分析PCDM的基因特征，探索PCDM潛在的分子標(biāo)志物。

資料與方法

一、一般資料與分組

通過TCGA數(shù)據(jù)庫(http://gdac.broadinstitute.org)下載PC臨床數(shù)據(jù)和相應(yīng)的基因組mRNA芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)。臨床病理數(shù)據(jù)包括185例PC患者的信息，主要有性別、年齡、腫瘤分期、放療、藥物治療、伴隨疾病、復(fù)發(fā)和預(yù)后情況等；基因組mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)包含其中183例PC腫瘤樣本的20 531個基因的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Quantile標(biāo)準(zhǔn)化及l(fā)og2處理。將既往無糖尿病的PC患者歸為PC組(109例)，PC確診前2年內(nèi)新發(fā)糖尿病的患者歸為PCDM組(11例)，排除63例糖尿病病史超過2年的PC患者。

二、基因表達(dá)差異分析

采用R軟件“l(fā)imma”程序包[5]，比較PCDM組與PC組基因表達(dá)量的差異，以|log2fold change|>2且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)并繪制“火山圖”。

三、DEGs的功能富集分析

使用R軟件“clusterProfiler”程序包對DEGs進(jìn)行功能富集分析，包括基因本體(gene ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析[6]。其中GO分析包括生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分分析。

四、構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)

通過STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析PCDM的DEGs相互作用的關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape軟件(3.7.2版本)將結(jié)果可視化，最后通過MCODE模塊篩選樞紐基因。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用R軟件(3.5.2版本)整理數(shù)據(jù)，通過貝葉斯檢驗(yàn)比較PCDM組與PC組的基因表達(dá)量。連續(xù)性變量的組間比較采用方差分析，分類變量比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PCDM組與PC組的臨床病理特征

PCDM組和PC組患者的一般資料及臨床病理特征的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 胰腺癌相關(guān)糖尿病組與胰腺癌組的臨床病理特征比較

二、PCDM的DEGs

與PC組比較,PCDM組有107個DEGs(|log2fold change|>2且P<0.05)，其中47個基因明顯上調(diào)，60個基因明顯下調(diào)(圖1，表2)。

圖1 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異表達(dá)基因的火山圖

表2 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異表達(dá)基因

三、PCDM 107個DEGs的功能富集分析

對107個PCDM DEGs的GO功能分析發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)功能方面，基因的主要功能為正向調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌和維持細(xì)胞鈣離子的穩(wěn)態(tài)(圖2A)；在細(xì)胞組分方面，基因的主要功能與小泡腔、細(xì)胞質(zhì)微管腔和細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)(圖2B)；在分子功能方面，基因主要參與受體活性調(diào)節(jié)及碳水化合物的結(jié)合(圖2C)。KEGG通路富集分析顯示，107個DEGs主要參與細(xì)胞因子、受體間相互作用，病毒蛋白與細(xì)胞因子受體的相互作用及趨化因子信號等通路(圖2D)。

圖2 胰腺癌相關(guān)糖尿病差異基因功能及通路富集分析

四、PCDM 107個DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及樞紐基因

通過STRING數(shù)據(jù)庫，基于107個PCDM的DEGs構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)；通過MCODE模塊識別了5個樞紐基因，分別為GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R(圖3)。

圖3 胰腺癌相關(guān)糖尿病特征基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

討 論

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，5年生存率僅8%[7]。發(fā)病隱匿、缺少特異性標(biāo)志物、易早期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后不良的主要原因，因此探索胰腺癌早期始動基因和相關(guān)機(jī)制對于早期診斷、提高生存率有重要意義。糖尿病與胰腺癌相互影響、互為因果、關(guān)系密切[8]。研究顯示糖尿病是胰腺癌的危險因素。Lu等[9]對新發(fā)2型糖尿病患者隨訪發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者罹患胰腺癌風(fēng)險高于非糖尿病患者；在糖尿病診斷5年內(nèi)隨訪，第1年的胰腺癌發(fā)病率最高。同健康人群相比，新發(fā)糖尿病患者罹患胰腺癌的概率提高了8倍，特別是PCDM的患者大部分是在胰腺癌診斷數(shù)年前被診斷糖尿病[8]。因此推測新發(fā)糖尿病可能是胰腺癌早期臨床表現(xiàn)之一[10]。

鑒別新發(fā)糖尿病尤其是PCDM，對于胰腺癌的早期診治具有重要的臨床意義[11]。對新發(fā)糖尿病患者進(jìn)行PCDM的篩查是診斷無癥狀胰腺癌和提高胰腺癌患者生存率的重要手段之一[12]。Illes等[13]定期隨診115例新發(fā)2型糖尿病患者，進(jìn)行CA19-9檢測和超聲檢查，必要時CT檢查，結(jié)果顯示其中10例CA19-9升高，但未發(fā)現(xiàn)胰腺癌，而3例CA19-9正常的隨訪者被確診為胰腺癌，可見CA19-9不宜作為PCDM的分子標(biāo)志物。PCDM可能與腫瘤所致胰島素抵抗、癌組織釋放過多的細(xì)胞因子和胰島淀粉多肽、自身免疫紊亂、腫瘤細(xì)胞破壞胰島等因素有關(guān)[14]。因此通過探索PCDM的特征性基因，以此為出發(fā)點(diǎn)尋找潛在的分子標(biāo)志物可能為胰腺癌的早期診斷提供新的思路。

近年來，TCGA數(shù)據(jù)庫不僅提供了人體常見腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，還公布了臨床病理數(shù)據(jù)及長期隨訪數(shù)據(jù)，是研究基因與腫瘤表型關(guān)系的寶貴資源。基于此，本研究借助TCGA-PC數(shù)據(jù)集，將患者分為PCDM組和PC組，結(jié)果顯示兩組在臨床病理特征方面無明顯差異，在107個DEGs中，GNG8、CNR2、GALR2、CXCL13、NPY2R可能是PCDM的特征性基因。

CNR2是大麻素CB2受體基因，與胰島素分泌相關(guān)。研究顯示，CB2受體在胰島β細(xì)胞表達(dá)；在人胰島細(xì)胞灌注實(shí)驗(yàn)中，CB2受體激動劑可通過開放鈣離子通道，促進(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素[15]。此外CNR2的激活還可以通過EGF/EGFR和IGF-I/IGF-IR通路抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示PCDM組CNR2表達(dá)明顯下調(diào)，可能與胰島素分泌不足及抑癌作用受損有關(guān)。

GALR2為2型Galanin受體，是一種抗糖尿病和抗炎神經(jīng)肽。文獻(xiàn)提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GALR2可以促進(jìn)糖代謝，其高表達(dá)可以抑制胰島素抵抗，避免血糖升高[17]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示激活GALR2可減輕肥胖小鼠骨骼肌的胰島素抵抗[18]。本研究結(jié)果顯示，PCDM組GALR2作為樞紐基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示該基因表達(dá)下調(diào)有可能引起胰腺癌相關(guān)糖尿病的發(fā)生。此外，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在裸鼠-人頭頸癌細(xì)胞皮下成瘤模型中，GALR2通過p38-MAPK信號通路介導(dǎo)促血管生成細(xì)胞因子、VEGF和IL-6的分泌，誘導(dǎo)血管生成，導(dǎo)致頭頸部鱗狀細(xì)胞癌侵襲性生長[19]；在涎腺導(dǎo)管癌，GALR2處于高甲基化狀態(tài)，與預(yù)后不良相關(guān)[20]；Galanin蛋白作為一種腫瘤抑制蛋白，在胃癌發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[21]。但GALR2在胰腺癌的作用尚無報道，具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

CXCLl3在人體肝臟、血清和淋巴結(jié)均有表達(dá)，具有吸附B細(xì)胞的能力，被稱為B細(xì)胞吸附因子。在正常小鼠胰島中CXCL13過表達(dá)，可通過吸附淋巴細(xì)胞，形成異位淋巴結(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，外周淋巴組織如脾、淋巴結(jié)功能的維持均需要CXCLl3的參與。此外胰島β細(xì)胞的形成也依賴于CXCLl3的正常表達(dá)，如在非肥胖型糖尿病小鼠注射CXCLl3趨化因子，可阻斷糖尿病進(jìn)展[22]。鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌組織中CXCL13作為一種趨化因子具有招募免疫細(xì)胞、抑制腫瘤生長的作用[23-24]。本研究顯示PCDM組CXCL13明顯下調(diào)，提示CXCL13可能參與胰腺癌新發(fā)糖尿病的發(fā)生，并在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。

NPY2R為男性糖尿病患者的神經(jīng)肽Y受體2[25]，其高表達(dá)與糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)展相關(guān)，如在1型糖尿病患者隊(duì)列研究中，NPY2R可能與嚴(yán)重糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變有關(guān)[26]。也有研究顯示，NPY2R在伴有糖尿病的心臟病患者的右心房肌肉組織中表達(dá)明顯降低,可能與器官特異性有關(guān)[27]。此外，NPY2R還參與了某些腫瘤的發(fā)生過程[28]，如在口腔癌患者中，NPY2R啟動子甲基化更容易引起腫瘤復(fù)發(fā)[29]；在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，NPY2R的TT基因型頻率明顯增高[30]。可見，NPY2R與糖尿病及腫瘤均相關(guān)，但在胰腺癌的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究由于受TCGA-PC數(shù)據(jù)集中病例樣本的限制，無法將正常胰腺與糖尿病患者的胰腺組織進(jìn)行對比，影響了結(jié)果的特異性。PCDM組樣本偏少也影響了結(jié)果的可信度，因此擴(kuò)大樣本量，收集適宜的胰腺組織樣本，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析有可能揭示PCDM的始動因素，進(jìn)而為胰腺癌的早期診斷篩選可靠的新型分子標(biāo)志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突