基于JAK1/STAT6通路探討安腸愈瘍湯對HT-29細胞炎癥模型的影響及機制研究*

孫大娟 ，樊靜娜 ，王 帥 ，遲莉麗

（1.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250014；2.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南 250014）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1]。目前認為UC的發病是由遺傳易感性、環境因素、自身免疫調節失衡、腸道菌群紊亂等多方面因素相互影響共同作用引起的腸黏膜屏障損傷[2]，故 Giovanni又稱 UC 為“屏障器官性疾病”[3]。腸道黏膜屏障的完整性在UC的發病機制中起著重要作用，故修復損傷的腸道黏膜屏障是治療UC的關鍵所在。安腸愈瘍湯是導師遲莉麗教授臨證治療UC總結的經驗方，具有健脾益氣、清解化濕、調氣活血的功效，臨床療效顯著[4-5]。課題組前期研究發現安腸愈瘍湯可明顯下調UC大鼠致炎因子白細胞介素（IL）-1β、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，上調抗炎因子IL-10、IL-13的表達，上調腸黏膜修復因子腸三葉因子（TFF3）、黏蛋白 2（MUC2）的表達，具有較好的抗炎及促進黏膜修復的作用[6-9]。但是對于安腸愈瘍湯調控TFF3分子的上游調控通路研究尚不明確，有研究表明蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）/信號轉導和轉錄活化因子 6（STAT6）信號通路廣泛參與細胞生長、分化、增殖、炎癥和調節免疫功能等過程，在UC的發病中調控著重要的免疫應答反應[10-13]。本實驗在前期研究基礎上，使用脂多糖（LPS）誘導建立人結直腸腺癌細胞（HT-29細胞）炎癥模型，從體外實驗觀察安腸愈瘍湯對JAK1/STAT6通路的影響，并探討其作用機制。

1 材料

1.1 細胞 HT-29細胞（上海中橋新舟生物科技有限公司，批號：Cat.#ZQ0057）。

1.2 藥物制備 安腸愈瘍湯（生黃芪30 g，炒白術30 g，薏苡仁 30 g，敗醬草 30 g，黃連 9 g，黃芩 9 g，木香 9 g，檳榔 15 g，地榆炭 15 g，白及 12 g，當歸9 g，炒白芍 12 g，防風 6 g，生甘草 9 g）藥材購于山東中醫藥大學附屬醫院，煎煮、過濾、濃縮后置于旋轉蒸發儀中蒸發至濃稠不流動狀態，烘干制成浸膏。稱量后完全溶解于DMEM培養基中，使用無菌注射器取溶解后液體通過0.22 μm濾膜除菌制成無菌藥品溶液，干預時使用DMEM培養基配置成相應濃度的含藥培養基進行孵育。5-氨基水楊酸（5-AS，商品名：美沙拉秦，批號：Cat.SA5260，Lot.518A021，購自北京索萊寶科技有限公司）溶解于二甲基亞砜（DMSO），后溶解于DMEM培養基中再配置成相應濃度進行干預。

1.3 試劑 四甲基噻唑藍MTT（批號：Lot.#303H0525，購自北京索萊寶科技有限公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[Perfect Real Time，批號：Cat.#RR047A，Lot.#AI12361A，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（takara中國）]，辣根酶標記山羊抗兔IgG（批號：Cat.#ZB-2301，購自北京中杉金橋生物技術有限公司），人類IL-13、TFF3酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號分別為：Cat.E-EL-H0104c，Lot.3YVV1HYY3U 及 Cat.E-ELH1108c，Lot.LRQW8J1JW6，購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），兔多克隆IL-13、JAK1抗體（批號分別為：ab106732、ab47435，購自英國Abcam公司），兔單克隆STAT6、TFF3抗體（批號分別為：ab32520、ab108599，購自英國 Abcam 公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）（批號：Cat.A0562，購自上海碧云天生物科技有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批號：Cat.C1005，購自上海碧云天生物科技有限公司）。

1.4 儀器 EVOSTMFLoid倒置熒光顯微鏡（購自美國 Thermo Fisher Scientific公司），Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra電泳系統（購自美國Bio-Rad公司），Fluor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統（購自美國Protein simple公司），Light Cycler 480Ⅱ熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（購自德國Roche公司）。本研究在山東中醫藥大學附屬醫院實驗中心完成。

2 方法

2.1 HT-29細胞炎癥模型建立 HT-29細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，加入LPS 20 μg/mL[14-15]孵育 24 h（LPS 組），以未經 LPS 處理的細胞作為對照組。提取核糖核酸（RNA）應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Q-RT-PCR）技術檢測IL-8、IL-13 mRNA的表達。

2.2 安腸愈瘍湯濃度的篩選 在前期研究基礎上，安腸愈瘍湯分設 0.01、0.1、1、5、10、25、50 mg/mL 7個濃度梯度，以正常未處理HT-29細胞為對照組，采用MTT法觀察不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29活力的影響，并采用Q-RT-PCR法檢測IL-8 mRNA表達變化。

2.3 分組及干預 實驗細胞分為6組，空白組：加入完全培養基孵育，不做任何處理；模型組：給予LPS（20 μg/mL）干預 24 h；安腸愈瘍湯各濃度組：LPS（20 μg/mL）干預 24 h 后再給予安腸愈瘍湯（低、中、高濃度）孵育 24 h；5-AS 組：LPS（20 μg/mL）干預24 h后再給予5-AS（1 mg/L）孵育24 h。

2.4 應用ELISA法檢測各組IL-13、TFF3的分泌水平 取細胞培養上清1 000×g離心20 min，取上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測IL-13、TFF3的表達水平。

2.5 應用免疫熒光檢測各組IL-13、TFF3的熒光強度 各組以1×104/孔細胞密度接種到鋪好細胞爬片的24孔板內，干預24 h后棄培養基，多聚甲醛固定、TritonX-100通透、山羊血清封閉，每孔加入一抗（1∶200），濕盒4℃孵育過夜，FITC標記的二抗室溫避光孵育1 h，DAPI染核5 min，抗熒光衰減封片劑封片后于熒光顯微鏡下采集圖像，應用Image J軟件分析抗體表達。

2.6 Q-RT-PCR 檢測各組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA的表達 收集干預24 h的細胞，按Trizol說明書提取細胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA模板，以此cDNA模板采用Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH作為對照，采用2-ΔΔCt法計算組間對應基因的表達差異。實驗用各引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 應用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測IL-13、JAK1、STAT6、TFF3蛋白的表達 提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白上樣緩沖液，配制SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白電泳，濕轉、封閉后放入到 IL-13（1∶1 000）、TFF3（1∶5 000）、JAK1（1∶2 000）、STAT6（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）的一抗孵育盒中4℃過夜，次日洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜。發光液顯色，凝膠系統成像。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較若方差齊采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，多組間比較若方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HT-29細胞炎癥模型的建立 與對照組比較，模型組細胞IL-8 mRNA表達明顯上調（P＜0.01），IL-13 mRNA 表達明顯下調（P＜0.01），說明炎癥模型建立成功，見表2。

表2 LPS誘導的 HT-29細胞 IL-8、IL-13的表達（±s）Tab.2 The expression of IL-8，IL-13 in HT-29 cells induced by LPS（±s）

表2 LPS誘導的 HT-29細胞 IL-8、IL-13的表達（±s）Tab.2 The expression of IL-8，IL-13 in HT-29 cells induced by LPS（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組別對照組模型組IL-8 IL-13 1.00±0.11 1.00±0.06 10.89±1.80* 0.27±0.04*

3.2 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細胞活力的影響 與對照組比較，模型組對HT-29細胞具有明顯促增殖作用（P＜0.01）；與模型組相比，安腸愈瘍湯在濃度為 0.01、0.1、1、5、10 mg/mL 時對 HT-29 具有明顯的促增殖作用（P＜0.01），在 25、50 mg/mL 時有抑制作用（P＜0.01）。0.01、0.1、10 mg/mL 3 組組間比較差異有統計學意義（P＜0.01），0.1 mg/mL 與 1 mg/mL組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。1 mg/mL組與5 mg/mL組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。選擇安腸愈瘍湯0.1、1、10 mg/mL進行后續實驗，見表3。

分別采用安腸愈瘍湯0.1、1、10 mg/mL濃度干預LPS誘導的HT-29 24 h后，采用Q-RT-PCR檢測IL-8 mRNA表達，結果顯示：與對照組比較，模型組IL-8 mRNA表達上調（P＜0.01）；與模型組比較，安腸愈瘍湯 0.1、1、10 mg/mL組表達均下調（P＜0.01）；3組間兩兩比較有差異（P＜0.01）。因此選取0.1、1、10 mg/mL 為后期實驗低、中、高濃度，見表 4。

表3 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細胞活力的影響（±s）Tab.3 Cell viability of HT-29 cells with different concentrations of AYR（±s）

表3 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細胞活力的影響（±s）Tab.3 Cell viability of HT-29 cells with different concentrations of AYR（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.01 mg/mL組比較，▲P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n OD562對照組 3 0.53±0.02模型組 3 0.75±0.03*安腸愈瘍湯0.01 mg/mL組 3 0.81±0.04#安腸愈瘍湯 0.1 mg/mL 組 3 0.88±0.04#▲安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 3 0.93±0.04#△安腸愈瘍湯5 mg/mL組 3 0.94±0.05#安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 3 1.01±0.04#▲△△安腸愈瘍湯25 mg/mL組 3 0.68±0.03#安腸愈瘍湯50 mg/mL組 3 0.28±0.04#

表4 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細胞IL-8 mRNA表達的影響（±s）Tab.4 Expression of IL-8 mRNA levels by different concentrations of AYR in HT-29 cells（±s）

表4 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細胞IL-8 mRNA表達的影響（±s）Tab.4 Expression of IL-8 mRNA levels by different concentrations of AYR in HT-29 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組比較，▲P＜0.01；與安腸愈瘍湯1 mg/mL組比較，△P＜0.01。

組別 n IL-8對照組 6 1.00±0.06模型組 6 10.55±0.79*安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 6 5.78±0.50#安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 6 2.65±0.32#▲安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 6 1.35±0.14#▲△

3.3 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、TFF3分泌水平的影響 與對照組比較，模型組IL-13、TFF3表達減少（P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組 IL-13、TFF3分泌均增多（P＜0.05或 P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3表達高于中、低濃度組（P＜0.01），安腸愈瘍湯高濃度組 IL-13、TFF3表達與5-AS組比較無統計學差異（P＞0.05）。見表5。

3.4 安腸愈瘍湯對LPS誘導HT-29細胞IL-13、TFF3熒光強度的影響 以對照組熒光強度為100%，免疫熒光分析結果顯示：與對照組相比，模型組 IL-13、TFF3熒光強度降低（P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組IL-13、TFF3熒光強度均增強（P＜0.05或P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3熒光強度高于中、低濃度組（P＜0.01），安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3熒光強度低于美沙拉秦組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 6、圖 1、圖 2。

表5 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、TFF3分泌的影響（±s）Tab.5 IL-13，TFF3 secretion in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） pg/mL

表5 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、TFF3分泌的影響（±s）Tab.5 IL-13，TFF3 secretion in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯10 mg/mL組比較，▲P＜0.01。

組別 n對照組 3模型組 3安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯10 mg/mL組 3 5-AS組 3 IL-13 TFF3 34.66±1.64 238.85±16.47 19.41±1.71* 179.86±6.87*21.65±1.15#▲ 198.61±7.76##▲26.45±1.14##▲ 227.61±9.98##▲33.53±2.64## 246.12±8.93##35.26±2.29## 253.37±6.15##

表6 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、TFF3熒光強度影響（±s）Tab.6 Fluorescent intensity of IL-13，TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） %

表6 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、TFF3熒光強度影響（±s）Tab.6 Fluorescent intensity of IL-13，TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） %

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯10 mg/mL組比較，▲P＜0.01。

組別 n對照組 3模型組 3安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯10 mg/mL組 3 5-AS組 3 IL-13 TFF3 100.00±9.62 100.00±5.93 53.89±6.51* 70.82±0.88*68.06±4.68#▲ 82.56±7.35#▲82.41±4.86##▲ 91.53±3.81##▲104.99±7.23## 106.78±7.36##116.26±6.58## 116.18±8.18##

圖1 安腸愈瘍湯對LPS誘導HT-29細胞IL-13熒光強度Fig.1 The fluorescent intensity of IL-13 in HT-29 cells induced by LPS with AYR

3.5 安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA和蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA和蛋白表達均下調，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達均上調（P＜0.05或 P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達高于中、低濃度組，差異有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），高濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達與5-AS組無統計學差異（P＞0.05）。中藥中、低濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白的表達低于5-AS組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表7、表 8、圖 3。

圖2 安腸愈瘍湯對LPS誘導HT-29細胞內TFF3表達影響Fig.2 The fluorescent intensity of TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR

表7 各組mRNA表達（±s）Tab.7 Expression of mRNA levels in each group（±s）

表7 各組mRNA表達（±s）Tab.7 Expression of mRNA levels in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與 5-AS 組比較，△P＜0.01。

組別對照組模型組安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組安腸愈瘍湯1 mg/mL組安腸愈瘍湯10 mg/mL組5-AS組n 3 3 3 3 3 3 IL-13 JAK1 STAT6 TFF3 1.00±0.03 1.00±0.07 1.00±0.07 1.00±0.05 0.22±0.06** 0.36±0.02** 0.21±0.13* 0.32±0.06*2.04±0.43#▲▲△ 1.73±0.06#▲▲△ 4.00±0.33#▲▲△ 1.77±0.09#▲▲△2.54±0.36#▲△ 2.47±0.22#▲▲△ 4.76±0.15#▲▲△ 2.35±0.25#▲▲△3.09±0.16# 3.36±0.12# 6.42±0.56# 3.30±0.28#3.31±0.40# 3.58±0.24# 6.95±0.74# 3.52±0.14#

4 討論

UC的治療目標是在誘導及維持臨床癥狀緩解的基礎上強調黏膜愈合[16-17]，修復損傷的腸道黏膜屏障是UC治療的關鍵。安腸愈瘍湯是治療UC的經驗方，臨床療效確切，前期臨床研究[4-5]發現其對UC患者內鏡黏膜愈合及組織病理學炎癥的緩解均有著良好的療效。前期實驗研究[6-9]發現安腸愈瘍湯能上調血清中抗炎因子IL-13以及腸道黏膜修復因子TFF3、MUC2的表達，具有良好的抗炎及促進黏膜修復的作用。但是對于安腸愈瘍湯調控TFF3分子的上游調控通路研究尚不明確，研究表明IL-13可通過STAT6途徑上調TFF3 mRNA及蛋白水平的表達[18]。蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號轉導和轉錄活化因子（STAT）信號通路涉及實體腫瘤、淋巴瘤以及炎癥性疾病[19]等的發病機制，研究發現JAK1/STAT6通路在UC的發病中起著重要調控作用[8-11，20]。JAK1/STAT6主要由IL-4、IL-13激活[21]以啟動信號轉導和轉錄的功能。STAT6在Th2細胞的分化中有著重要的影響，影響B細胞抗原呈遞的細胞表面分子表達，調節IL-10等炎癥因子的表達[22]。有研究發現STAT6-/-的小鼠在三硝基苯磺酸（TNBS）誘導后出現了腸道黏膜傷口的愈合延遲，與對照組比較抗炎細胞因子IL-10顯著下降。還有研究發現通過調控JAK1/STAT6通路調節一氧化氮合成酶（iNOS）和干擾素-γ（IFN-γ）的生成發揮對腸黏膜炎癥的保護作用[23]。本研究在前期研究基礎上進一步從體外實驗探討安腸愈瘍湯對JAK1/STAT6通路的影響。

表8 各組蛋白表達（±s）Tab.8 Protein expression in each group（±s）

表8 各組蛋白表達（±s）Tab.8 Protein expression in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組比較，▲P＜0.01；與 5-AS 組比較，△P＜0.01。

組別 JAK1 STAT6 TFF3對照組 0.89±0.01 0.63±0.03 1.01±0.01模型組 0.75±0.03* 0.45±0.05* 0.83±0.02*安腸愈瘍湯 0.1 mg/mL 組 0.89±0.01##▲△ 0.59±0.04##▲△ 1.02±0.01##▲△安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 0.95±0.01##▲△ 0.70±0.03##▲△ 1.14±0.01##▲△安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 1.15±0.01## 1.12±0.04## 1.25±0.02##5-AS 組 1.17±0.02## 1.12±0.06## 1.24±0.05##n 3 3 3 3 3 3 IL-13 1.11±0.01 0.52±0.04*0.57±0.04#▲△0.70±0.03##▲△1.05±0.02##1.08±0.03##

圖3 各組蛋白的表達Fig.3 Protein expression in each group

既往研究[14-15]采用LPS干預HT-29細胞構建體外炎癥模型，LPS刺激細胞后可導致大量炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8的釋放，而且還會進一步生成并釋放炎癥因子如白三烯等[24]，是常用的構建細胞炎癥模型的誘導因子。在既往基礎上課題組又進行了炎癥模型的驗證，IL-8是重要的炎癥趨化因子，由LPS刺激HT-29細胞后激活TLR4/NF-κB通路產生[25]，IL-13是重要的抗炎因子，本研究中發現LPS干預HT-29細胞后出現致炎因子IL-8上升以及抗炎因子IL-13下降，提示模型構建成功。國內炎癥性腸病治療指南推薦5-AS作為輕中度UC的一線用藥，有良好的抗炎調節免疫作用，有研究表明5-AS可以通過抑制前列腺素的合成及白三烯的釋放從而起到抗炎作用，還能抑制炎癥因子的釋放減輕腸道黏膜炎癥反應[26]，因此選擇5-AS作為陽性對照藥物。

本研究結果顯示，安腸愈瘍湯可能通過上調IL-13的分泌，激活JAK1/STAT6通路，促進黏膜修復因子TFF3的分泌，減輕HT-29細胞炎癥模型的炎癥反應，發揮保護作用。安腸愈瘍湯具有劑量依賴性的作用特點，高濃度組作用優于中、低濃度組，但與5-AS組比較未見明顯優勢。本實驗初步探討了安腸愈瘍湯對LPS誘導的HT-29細胞炎癥模型可能的保護機制，顯示出安腸愈瘍湯對腸道黏膜良好的修復作用。今后將從UC大鼠模型體內實驗進一步探討安腸愈瘍湯對腸道黏膜屏障的保護機制。