基于網絡藥理學和分子對接方法的肺維康顆粒治療COVID-19相關肺纖維化的機制分析

楊帆，李宛洋，曹仁爽，畢張揚，張偉

1山東中醫藥大學中醫學院，濟南250014；2中南大學湘雅公共衛生學院；3山東中醫藥大學附屬醫院

自2019年底至2020年3月下旬，新型冠狀病毒(2019-nCoV)已在我國肆虐3個月之久，全國超8萬人感染。世界衛生組織將2019-nCoV引起的肺炎命名為COVID-19，目前國內已有大批患者治愈出院進入恢復期。但影像學研究顯示，COVID-19患者在初診時即有纖維索條灶形成，部分患者治療后復查CT顯示伴有纖維索條灶[1]，而重癥COVID-19死亡患者也存在肺間質纖維化的病理特點[2]。2020年3月，山東中醫藥學會肺系病專業委員會、山東省醫師協會中醫肺系病醫師分會制訂《中醫藥調治新冠肺炎恢復期專家共識》，該共識建議應用肺維康顆粒治療COVID-19相關肺纖維化(COVID-19-PF)。網絡藥理學一種是建立在網絡數據庫檢索及高通量組學數據分析基礎上的生物信息網絡構建及網絡拓撲結構分析策略[3～5]，分子對接是通過分析受體與分子之間的相互作用等方式來預測其結合模式和親合力的一種模擬方法[6]。2020年3月，本研究應用網絡藥理學和分子對接方法，對肺維康顆粒治療COVID-19-PF的潛在成分、靶點及作用機制進行系統性探索，以期為COVID-19-PF的基礎研究及相關藥物研發提供理論依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 肺維康顆粒活性化合物與防治COVID-19-PF的靶點獲取 通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，檢索肺維康顆粒中十味中藥(黃芪、白術、防風、丹參、地黃、山藥、山萸肉、茯苓、淫羊藿、麥冬)的有效成分。本研究以數據庫所建議的口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18建立閾值篩選候選化合物。活性化合物作用靶點通過檢索TCMSP數據庫逐一配對整理獲取，同時檢索GeneCard、OMIM數據庫，以novel coronavirus、pulmonary fibrosis為關鍵詞，得到COVID-19-PF相關基因。利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/)數據庫查詢靶點蛋白對應的基因名稱，對靶點蛋白標準化，建立數據集。應用R軟件包，對肺維康顆粒活性成分作用的靶點及疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，獲得共同靶點基因。

1.2 藥物-化合物-靶點-疾病網絡構建 將候選化合物與二者的共同靶點基因上傳至Cytoscape3.7.1軟件，生成體現藥物-化合物-靶點-疾病相互作用的四元綜合網絡圖。

1.3 藥物-疾病靶點蛋白相互作用網絡構建 將篩選出的共同靶點基因導入STRING(https://string-db.org/)與Metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)平臺，將蛋白種類定義為Homo sapiens并進行篩選，獲得蛋白互作網絡圖(PPI網絡圖)，并進行MCODE模塊分析。應用R軟件包，繪制條形圖展示關鍵靶點在網絡中相互作用的頻次(Degree)。

1.4 GO功能與KEGG富集分析 應用R語言軟件包和Metascape平臺，對共同靶點基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，根據篩選出的信號通路繪制條形圖、氣泡圖。對GO功能分析功能相似的條目進行聚類分析，并構建相互作用網絡，對KEGG富集分析的通路結果繪制靶點-通路網絡。

1.5 分子對接 在PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫，以人(Human)來源檢索相關化合物與關鍵靶點的晶體結構；采用AutoDockTool軟件進行去水、加氫等預處理，采用Discovery studio軟件進行分子對接；分析結合能值，該數值為負則提示能自由結合[9]。本研究設定結合能<-5 kcal/mol(20.9 kJ/mol)為結合具有顯著性，以此佐證肺維康顆粒在COVID-19-PF中應用的合理性。

2 結果

2.1 肺維康顆粒-化合物-靶點-COVID-19-PF網絡的構建結果 以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，結合文獻手動篩選結果，共得到肺維康顆粒候選化合物186個，其中淫羊藿23個、地黃2個、山茱萸20個、山藥16個、黃芪20個、茯苓15個、防風18個、丹參65個、白術7個。靶點數較多的化合物包括槲皮素、5-O甲基維斯阿米醇、山奈酚、薯蕷皂苷元、芒柄花黃素、異鼠李亭等，基本覆蓋了肺維康顆粒中已知的關鍵活性成分。在TCMSP數據庫中逐一對應靶點，重復靶點僅保留1個，共得到2 558個化合物靶點。基于uniprot數據庫進行靶點信息基因名標準化，得到1 911個靶點。

2.2 PPI網絡圖的構建結果 韋恩圖結果顯示，肺維康顆粒化合物與COVID-19-PF有190個共同靶點基因。PPI網絡包含190個蛋白質節點、3 474條相互作用關系(連線)。根據節點的Degree繪制前30個關鍵蛋白質節點的條形圖，見圖1。Degree≥100的節點包括蛋白激酶(AKT1)、白細胞介素6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、Caspase-3、表皮生長因子受體(EGFR)，其中Degree最高的3個蛋白質節點分別為AKT1、IL-6、VEGFA(Degree分別為127、115、109)。MCODE模塊分析顯示，log10<-6的模塊一共有7個，同一模塊內的蛋白有著更為緊密的聯系；排名前三的模塊具有較顯著的生物學意義，其中模塊1與血管生成和重塑有關，模塊2與炎癥反應和細胞周期調控相關，模塊3與膠原重塑、氧化應激、纖維化有關。

圖1 PPI網絡中的關鍵節點

2.3 GO基因功能與KEGG信號通路富集分析結果 對190個共同靶點進行GO基因功能分析，共得到生物過程180條，通路富集分析共得到KEGG信號通路165條，見圖2。GO功能相似條目聚類分析與相互作用結果顯示，核受體活性、轉錄因子活性(TFA)、類固醇激素受體、腎上腺素能受體活性、G蛋白偶聯胺受體活性等因子富集較多。KEGG通路富集篩選結果顯示，與COVID-19-PF相關的通路主要為PI3K/AKT、AGE/RAGE、IL-17、Influenza A、TNF信號通路等。

2.4 分子對接結果 肺維康顆粒特征性成分薯蕷皂苷元、二氫丹參酮Ⅰ、木犀草素及常用于治療肺纖維化的藥物吡非尼酮與血管緊張素轉化酶2(ACE2)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、AKT1的分子對接結合能均<-5 kcal/mol，其分子對接模式見圖3。

3 討論

截至2020年3月22日24時，國內現有COVID-19確診病例5 120例，累計治愈出院病例72 703例[7～10]，表明目前疫情已轉入恢復期治療階段。針對患者恢復期的調養，國家中醫藥管理局印發了新型冠狀病毒肺炎恢復期中醫康復指導建議[11]，但該建議未有針對COVID-19-PF的相關治療措施。COVID-19重癥患者2019-nCoV在肺組織內誘發細胞因子風暴，與其他病毒誘發肺纖維化的病理機制類似[12]。臨床上用于治療肺纖維化的藥物如糖皮質激素、吡非尼酮、尼達尼布等往往不能阻斷病程，但中西醫結合治療該病取得了一定的效果，如臨床觀察發現玉屏風散聯合糖皮質激素對放射性肺炎、肺纖維化具有良好的療效，療效評分顯著高于單用糖皮質激素[13]。考慮到COVID-19患者恢復期存在“復陽”情況、排毒時相較長，且長時間病毒感染更容易引起肺纖維化，共識將肺維康顆粒的應用時機界定至自恢復期始，經山東省藥品監督管理局快速備案[魯藥制備(應急)字Z2020002]后開始使用。本次專家共識推薦應用肺維康顆粒治療COVID-19-PF的機制尚不完全清楚，有待對其藥理機制進行探索。

注：A為GO功能分析氣泡圖；B為KEGG通路富集分析氣泡圖。

注：A為二氫丹參酮Ⅰ與ACE2的分子對接模式，結合能為-26.39 kcal/mol；B為二氫丹參酮Ⅰ與VEGFR的分子對接模式，結合能為-23.18 kcal/mol；C為薯蕷皂苷元與ACE2的分子對接模式，結合能為-33.17 kcal/mol；D為薯蕷皂苷元與AKT1的分子對接模式，結合能為-47.50 kcal/mol；E為木犀草素與AKT1的分子對接模式，結合能為-38.47 kcal/mol；F為木犀草素與VEGFR的分子對接模式，結合能為-35.10 kcal/mol；G為吡非尼酮與AKT1的分子對接模式，結合能為-22.72 kcal/mol；H為吡非尼酮與VEGFR的分子對接模式，結合能為-29.60 kcal/mol。

本研究網絡藥理學分析結果顯示，槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇、薯蕷皂苷元、二氫丹參酮Ⅰ、淫羊藿C是肺維康顆粒發揮療效的重要活性成分。研究證實，槲皮素通過降低TGF-β1、TNF-α表達和干預TGF-β1/Smad信號通路而減輕大鼠肺組織炎癥反應和纖維化[14]；漢黃芩素能夠抑制TNF-α和IL-1β表達，降低肺組織炎癥反應程度[15]。廖源等[16]以網絡藥理學方法分析了國家《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中期診療方，發現中期診療方可通過調控AKT1、IL-6、VEGFR等肺炎相關靶點發揮治療COVID-19的作用，與肺維康顆粒治療COVID-19-PF的核心作用靶點相似；提示肺維康顆粒不僅可以兼顧到早期COVID-19-PF患者仍可能存在2019-nCoV感染的特點，還能有效發揮對COVID-19的治療作用。本研究分子對接結果顯示，肺維康顆粒中的多種成分如木犀草素、薯蕷皂苷元，與AKT1、VEGFR的結合能均低于肺纖維化常用藥物吡非尼酮與上述靶點的結合能，表明肺維康顆粒在COVID-19-PF治療中有較高的應用價值。

本研究對藥物-疾病靶點蛋白相互作用網絡分析結果顯示，靶點AKT1、VEGFR、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8在網絡中占據核心地位。其中AKT1是mTORC2信號通路重要的下游靶蛋白，后者屬于磷脂酰肌醇3-激酶蛋白家族，被認為是調節細胞增殖、代謝及自噬的中心樞紐。AKT1可通過mTOR蛋白磷酸化而激活，并促進相關蛋白表達，進一步促進基因轉錄和蛋白質合成，在纖維化過程中具有重要作用[17]。因此,AKT1激活后可參與細胞凋亡、葡萄糖代謝和蛋白質合成過程，從而調節細胞存活和增殖，在肺纖維化過程中占據重要地位。VEGFR是VEGF的功能受體，是介導血管生成的重要靶點[18]，由此產生的異常損傷修復刺激成纖維細胞增殖、聚集，并促進上皮間質轉化、激活多條異常信號通路，進一步誘導成纖維細胞灶形成，并導致MMPs家族激活破壞肺泡結構、促進基質沉積和瘢痕形成。該機制也得到了后續GO功能和KEGG通路富集分析的驗證，推測肺維康顆粒可能通過調控PI3K/AKT等炎癥和纖維化相關通路、抑制細胞因子活化和血管生成、減輕膠原沉積和肺組織結構重塑，而發揮對COVID-19-PF的治療作用。

綜上所述，肺維康顆粒可能通過調控PI3K/AKT等炎癥和纖維化相關通路、抑制細胞因子活化和血管生成、減輕膠原沉積和肺組織結構重塑等發揮對COVID-19-PF的治療作用。本研究為基礎實驗研究和臨床應用提供了較全面的理論基礎，限于現有COVID-19相關數據的片面性，加之本方法不能預測活性成分劑量效應與藥物的相互作用，故研究結論具有一定局限，有待于后續采用動物體內外實驗進一步探討完善。