多靶點分子對接研究艾葉抗乙肝病毒的有效成分

王衛京，詹世平，丁仕強

（大連大學環境與化學工程學院，遼寧大連 116622）

1 概述

感染乙肝病毒（HBV）可導致慢性乙型肝炎，會發展成為肝硬化、肝癌等疾病。乙肝病毒感染是最嚴重的全球性公共衛生問題之一。目前用于抗乙肝病毒的藥物有兩種；

1）干擾素；

2）核苷類似物。

但這些藥物對乙肝病毒只能功能性抑制，一旦乙肝病毒發生變異，就會對藥物產生抗藥性。因此，研究新型抗乙肝病毒藥仍是一個十分緊迫的問題。

中藥治乙肝的歷史十分悠久，具有多途徑，副反應小，價格便宜的特點，是研究抗乙肝病毒藥物的一個重要領域。彭立生等研究了葉下珠提取物對乙肝病毒及X基因的抑制作用。王羿今利用數據挖掘研究了茵陳蒿湯治療慢性乙肝的作用機制。趙志鴻等研究了艾葉提取物對乙肝病毒抑制作用，結果表明，艾葉提取物對HBsAg和HBeAg的分泌有明顯的抑制作用，對HBV DNA的復制有一定的抑制作用，并呈劑量依賴性。

隨著生物信息學的發展，分子對接技術也越來越多地應用于中藥活性成分的分析。姚香草等采用分子對接研究了雞骨草抗乙肝病毒的活性分子，對接分數較高的主要為三萜皂苷類、有機酸類、黃酮類及氨基酸類成分。孫硯輝利用分析對接技術輔助篩選了氧化苦參堿治療乙型肝炎的蛋白結合靶標。周厚琴等通過分子對接技術分析了赤芍治療膽汁淤積型肝炎的作用機制，篩選了其中有顯著療效的成分。

乙肝病毒屬于嗜肝DNA病毒科，其病毒顆粒由病毒基因組、核衣殼和囊膜組成。HBV病毒基因組有四個開放閱讀框，編碼Core蛋白即核衣殼蛋白，pre-core蛋白，Pol蛋白，x蛋白以及S蛋白（L，M，S）。pre-core蛋白與HBeAg的合成與分泌有關，S蛋白是病毒包膜蛋白。與乙肝病毒復制有關的蛋白則為核衣殼蛋白，Pol蛋白即乙肝病毒聚合酶，以及x蛋白HBx。乙肝病毒核衣殼蛋白組成乙肝病毒核衣殼，對乙肝病毒的復制有重要作用。乙肝病毒聚合酶在裝配新的病毒顆粒以及由RNA逆轉錄DNA的過程中起關鍵作用，是核苷類藥物的作用靶點。乙肝病毒x蛋白HBx是一種多功能調節蛋白，它通過對信號通路、細胞周期等方面的調控，在HBV復制時起到重要作用。由于核衣殼蛋白，聚合酶以及HBx在乙肝病毒復制過程中作用十分重要，本研究就以這三種蛋白為靶點，篩選艾葉中的有效成分。

2 計算方法

艾葉的組分來源于TCMSP數據庫，以分子量小于500，氫鍵給體數目小于5，氫鍵受體數目小于10為標準先對其進行一輪篩選。用iGEMDOCK將艾葉組分和三個靶點分別進行分子對接，初步篩選出30個與靶點對接較好的組分。然后再用Ledock做進一步篩選，篩選出10個與靶點對接能較低的組分。

乙肝病毒核衣殼蛋白的晶體結構來源于蛋白質數據庫（http：//www.rcsb.org），PDB ID為5E0I，其結構如圖1所示。乙肝病毒聚合酶的晶體結構還沒有解析出來，本研究利用同源模建的方法構建其三維結構。首先在美國國立生物技術信息中心（NBCI）數據庫中找到乙肝病毒聚合酶的一級序列BAQ95565.1，然后利用BLAST程序在PDB庫中找到其同源性最高的蛋白質晶體6IK9作為建模模板，二者序列同源性為29.64%。在SWISS-MODEL網站進行同源模建，得到的蛋白質模型經拉氏圖評估后，其有1.4%的氨基酸不在合理區間內，模型較為合理。該模型結構，如圖2所示。

圖1 核衣殼蛋白結構

圖2 聚合酶模型結構

蛋白HBx目前也沒有解析出其晶體結構，而且在NBCI數據庫中也沒有找到與其同源性較強的蛋白質，但其含有154個氨基酸，氨基酸數目較少，故對其三維結構采用從頭預測的方法建模。在NBCI數據庫中找到該蛋白質的一級序列BAQ95563.1，上傳該序列至從頭預測網站QUARK，建立該蛋白質模型。該模型經拉氏圖評估后，有5.5%的氨基酸在不合理區間內，模型較為合理。得到的模型結構如圖3所示。

圖3 HBx蛋白模型結構

3 結果與討論

經過兩輪對接后，艾葉組分中與各靶點對接能位于前10的組分，如表1、2、3所示。

表1 艾葉組分與核衣殼蛋白的對接結果

表2 艾葉組分與聚合酶的對接結果

從表中的對接結果來看，總體上艾葉組分與乙肝病毒聚合酶的對接能最低，其次是HBx蛋白，而與核衣殼蛋白的對接能則與前兩個蛋白有一定差距。這表明艾葉對乙肝病毒的抑制作用主要是通過抑制聚合酶和HBx蛋白來實現，而對核衣殼蛋白的抑制作用相對較弱。很有可能聚合酶和HBx蛋白就是艾葉組分的作用靶點。

表3 艾葉組分與HBx蛋白的對接結果

從表2和表3可以看出，艾葉組分和聚合酶及HBx蛋白對接能均較低，其中與聚合酶的結合能整體上還要更低一點，這說明艾葉組分與聚合酶的結合能力更強一些。圖4和圖5分別是艾葉組分與HBx蛋白和聚合酶的對接位點情況。從圖4可以看出，不同艾葉組分與HBx的對接位點非常集中，能夠很好地抑制該蛋白的活性，但艾葉組分與聚合酶的結合就比較分散，特別是在圖5中，箭頭所指的有可能是逆轉錄活性區域，只有一個組分quercetin與之結合。在乙肝病毒中，HBx是一個多功能蛋白，它通過對細胞中各種蛋白及信號通路的調控，在HBV基因轉錄中起重要作用。HBV的RNA則是通過聚合酶逆轉錄成DNA，再裝配成新的病毒。而對接結果表明，艾葉組分對HBx蛋白活性抑制作用較強，進而也就抑制了HBV基因轉錄成RNA，然后再翻譯成蛋白質的過程。雖然艾葉組分與聚合酶的對接能較低，但位于可能的逆轉錄活性區域的組分卻只有一個，導致整體上艾葉組分對DNA的復制抑制作用較弱。這從側面印證了趙志鴻等[3]經實驗得到的結論：艾葉提取物可能作用于HBV的蛋白表達水平，而不在DNA復制階段。

圖4 艾葉組分和HBx的對接位點

圖5 艾葉組分和聚合酶的對接位點

在艾葉組分中，quercetin、eupatilin以及（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one均對三個靶點起到抑制作用，這體現了中藥的特點，即多個組分對多個靶點作用，使病毒很難產生抗藥性。組分quercetin對三個靶點均有較強的抑制作用，值得進一步研究。

4 結論

在乙肝病毒中，乙肝核衣殼蛋白，聚合酶以及HBx蛋白均對乙肝病毒的復制起重要作用。本文以這三種蛋白為靶點，用分子對接軟件iGEMDOCK和Ledock對艾葉組分進行研究。對接結果顯示，艾葉組分主要對HBx蛋白的抑制作用較強，而對核衣殼蛋白抑制作用較弱。艾葉組分和聚合酶的對接能雖然較低，但對接位點分散且在可能的逆轉錄區域結合組分少，削弱了艾葉組分對聚合酶的抑制作用。在艾葉中，多種組分對靶點蛋白有抑制作用，其中quercetin對三個靶點均有較強的抑制作用。