煙草低溫早花相關(guān)基因NtDUF599 的表達(dá)及功能分析

徐國(guó)云，翟 妞，許亞龍，謝小東，張 慧，鄭慶霞，張劍鋒，劉萍萍，陳千思，金立鋒，周會(huì)娜

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

煙草是一種喜溫不耐寒的葉用經(jīng)濟(jì)作物，在苗期遭受低溫后會(huì)引起早花現(xiàn)象，嚴(yán)重影響煙葉的質(zhì)量和產(chǎn)量［1-2］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，煙農(nóng)主要采用農(nóng)藝（移栽、打頂留杈等）、栽培（覆膜、調(diào)整育苗時(shí)間等）等措施來(lái)緩解低溫引起的早花問(wèn)題，但這些措施比較耗費(fèi)人力、物力且只能治表。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程可為改良煙草抵御低溫早花提供理論和技術(shù)支持。

在模式植物擬南芥中，一些參與調(diào)控低溫誘導(dǎo)早花的基因已被鑒定，并且分子作用機(jī)制也得到解析。例如HOS1 和FVE 基因缺失后，突變體均表現(xiàn)出耐寒性增強(qiáng)、花期改變等表型［3-5］。除了以上參與控制低溫誘導(dǎo)早花的基因，一些受逆境誘導(dǎo)的miRNA 也被發(fā)現(xiàn)參與了植物花期的調(diào)控［6-8］，這為研究逆境介導(dǎo)的早花提供了新視角。例如受低溫、干旱和高鹽誘導(dǎo)的miRNA169 可將NF-YA2降解，從而抑制FLC 的表達(dá)，最終延遲了擬南芥花期［9］。在擬南芥中，過(guò)量表達(dá)miRNA156 后會(huì)引起擬南芥花期推遲，同時(shí)耐逆性也得到增強(qiáng)［10］。Zhang 等［11］在栽培煙草中過(guò)量表達(dá)miRNA156 后同樣發(fā)現(xiàn)煙草花期推遲現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明miRNA156 參與花期調(diào)控的功能在不同物種之間存在保守性。

目前，關(guān)于煙草低溫早花的分子機(jī)制研究仍停留在初級(jí)階段，絕大部分的基因及其功能仍未明確。楊靜等［12］利用基因芯片分析了K326 和抗早花品系華煙06 莖尖端花芽分化過(guò)程中基因的表達(dá)情況，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO 分析，但未成功篩選到抗早花相關(guān)基因。林世峰等［13］采用同源克隆的方法從煙草NC82 中克隆到擬南芥開花抑制因子Nup96 的同源基因NtNup96，但只關(guān)注了該基因的表達(dá)分析，缺乏進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。白戈等［14］利用煙草基因芯片進(jìn)行了表達(dá)模式分析，篩選到NtMYB15 基因可能與煙草低溫早花相關(guān)。將該基因在煙草中沉默后，沉默植株在低溫處理后花期推遲，說(shuō)明NtMYB15 參與了煙草低溫早花的調(diào)控。總之，在分子生物學(xué)層面，煙草低溫早花的研究仍處于起步階段。篩選并鑒定煙草低溫早花相關(guān)基因，并利用基因工程手段改良現(xiàn)有煙草主栽品種，對(duì)于培育出耐低溫抗早花的煙草新品種具有重要的意義。基于前期RNA-Seq 分析結(jié)果，采用RNA-interfere（RNAi）技術(shù)對(duì)一個(gè)煙草低溫早花相關(guān)基因NtDUF599 開展了初步的功能分析，旨在明確該基因的功能并為煙草低溫早花改良育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：栽培煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.）和NC82 種植在國(guó)家煙草基因研究中心人工氣候室，溫度為26～28 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期為16 h 光 照/8 h 黑 暗。NC82 材 料 用于RNA-Seq 篩 選低溫早花候選基因，K326 材料用于遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制RNAi 轉(zhuǎn)基因材料。用于基因沉默的RNAi 干擾載體pBWA(V)HS-RNAi 來(lái)源于武漢伯遠(yuǎn)生物科技公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105 均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。

試劑：TriZol 試劑購(gòu)買自Invitrogen 公司；高保真DNA 聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；In-Fusion HD Cloning Plus 試劑盒購(gòu)于日本寶日公司；cDNA 合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自瑞士羅氏公司。

儀器：PCR 儀、移液器、離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)羅氏公司）；分析天平（感量0.01 mg，瑞士梅德勒公司）；凝膠電泳儀器及成像系統(tǒng)（美國(guó)普諾森公司）；Nanodrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司）；NanoPhotometer spectrophotometer（德國(guó)愛普科公司）；Agilent 2100 bioanalyzer（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 方法

1.2.1 低溫處理及轉(zhuǎn)錄組分析

NC82 在植物生長(zhǎng)室生長(zhǎng)至4 葉期，隨后將幼苗轉(zhuǎn)移至人工氣候箱進(jìn)行低溫處理（12 ℃，10 d）。處理結(jié)束后，采集的部分煙株葉片樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，其余煙株轉(zhuǎn)移到植物生長(zhǎng)室（正常條件）生長(zhǎng)至現(xiàn)蕾期，采集葉片樣品，其采集方法與4 葉期葉片樣品采集方法相同。苗期和現(xiàn)蕾期葉片樣品采集完成后，干冰運(yùn)輸至北京諾禾致源公司進(jìn)行RNA 提取及后續(xù)RNA-seq 測(cè)序。未遭受低溫處理且一直保持在正常條件下生長(zhǎng)的煙株為對(duì)照（CK1）。

RNA 提取后分別使用 NanoPhotometer spectrophotometer 和bioanalyzer 檢測(cè)純度和完整性，符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的RNA 交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)RNA-seq 測(cè)序。原始reads經(jīng)FastQC 質(zhì)量評(píng)估后獲得clean reads，隨后使用Bowtie2 軟件將clean reads 比對(duì)到煙草參考基因組（ftp：// ftp. solgenomics. net/ genomes/ Nicotiana_tabacum/）。采用Subread 軟件中的FeatureCounts工具對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量，使用DESeq2 軟件篩選不同狀態(tài)下表達(dá)水平差異顯著的基因。

1.2.2 低溫誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

低溫誘導(dǎo)表達(dá)模式分析：K326 在植物生長(zhǎng)室生長(zhǎng)至4 葉期，將幼苗轉(zhuǎn)移至人工氣候箱進(jìn)行低溫處理，溫度設(shè)置為12 ℃，分時(shí)間段取材（0、1、6、12、24、48 和96 h），樣品采集后迅速在液氮中研磨，粉末裝入1.5 mL 離心管后加入1 mL TriZol，上下顛倒混勻，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNA 提取及cDNA 合成

RNA 提取采用TriZol 法，步驟如下：-80 ℃保存的樣品在冰上凍融，加入200 μL 氯仿，振蕩混勻，離心后小心取出上層水相，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入500 μL 異丙醇，沉淀、離心分離出RNA，再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，加入適當(dāng)體積的RNase free 的水，充分溶解。提取后的RNA 使用NanoDrop 2000 檢 測(cè)RNA 濃 度 和 純 度。cDNA 第一鏈合成步驟參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。 NtDUF599 的 實(shí) 時(shí) 定 量 PCR 引 物 為qNtDUF599-F：5'-CTCACAGACAAATCTGATG-3'，qNtDUF599-R： 5'-CCTTTCAGATATGGATCA-3'。煙 草 26S rRNA 為 內(nèi) 參 基 因 ，Nt26S-F：5'-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'， Nt26S-R：5'-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng cDNA，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)循環(huán)閾值（Ct 值），用2-ΔΔCT方法［15］計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3 個(gè)技術(shù)重復(fù)和3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

(1)肖像描寫：①第一次出場(chǎng)：寫他“身材很高大”，說(shuō)明他尚有勞動(dòng)能力；“青白臉色”說(shuō)明他窮困潦倒。營(yíng)養(yǎng)不良又不肯勞動(dòng)的結(jié)果；臉上“時(shí)常夾些傷痕”，是他窮困而偶然偷竊被人打傷的標(biāo)志，也是他走向沒(méi)落的重要標(biāo)志。“一部亂蓬蓬的花白胡子”既表明他年齡較大而又精神委頓頹唐。他那件長(zhǎng)衫“又臟又破，似乎十多年沒(méi)有補(bǔ)，也沒(méi)有洗”說(shuō)明他窮酸潦倒，懶得出奇的經(jīng)濟(jì)狀況和性格特征。②第二次出場(chǎng)：“他臉上黑而且瘦，已經(jīng)不成樣子，穿著一件破夾襖”說(shuō)明他衣食無(wú)著，窮途末路。“盤著兩腿，下面墊著一個(gè)蒲包，用草繩在肩上掛住”“滿手是泥”說(shuō)明他被打折了腿，喪失生活能力。

1.2.5 NtDUF599基因沉默載體構(gòu)建

根據(jù)中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中NtDUF599 基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增NtDUF599 基因片段的引物，并在引物的5'端添加載體接頭序列，以方便利用In-Fusion 連接酶構(gòu)建RNAi 干擾載體。正向序列引物fNtDUF599-F：5'-AGAAGGTTGGTGACCTGCAGAATTCCATTAATC GTCAC-3'，fNtDUF599-R：5'-GAGAAAAACTAGA CCTGCAGAGAACGACCTTTGCTTCC-3'（下 劃 線為載體接頭序列）；反向序列引物rNtDUF599-F：5'-GATAGTTACAGAGCCCGGGAGAACGACCTTT GCTTCC-3'，rNtDUF599-R：5'-AGAAGGTTGGTG AGCCCGGGAATTCCATTAATCGTCAC-3'（下劃線為載體接頭序列）。PCR 擴(kuò)增體系如下所示：5×PrimerSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Misture（2.5 mM）4 μ L，上 下 游 引 物（10 μ M）各4 μ L，PrimerSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL，cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃10 s，55 ℃15 s，68 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶進(jìn)行DNA 片段回收待用。

首先利用限制性內(nèi)切酶Pst I 將pBWA(V)HS-RNAi 空載體切開，回收、純化線狀載體片段。隨后將載體片段、In-Fusion 酶以及正向NtDUF599基因片段按比例混勻，55 ℃反應(yīng)15 min。反應(yīng)體系如下：pBWA(V)HS-RNAi 空載體2 μL，基因片段6 μL，5×In-Fusion 酶2 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆并進(jìn)行菌落PCR 鑒定。陽(yáng)性單克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。利用Sma I 限制性內(nèi)切酶酶切連接有正向NtDUF599 基因片段的pBWA(V)HS-RNAi 中間載體，將反向NtDUF599 基因片段連接到中間載體，連接方法參照上文所述，最終獲得pBWA(V)HS-NtDUF599-RNAi 干擾載體。

1.2.6 煙草遺傳轉(zhuǎn)化

將pBWA(V)HS-NtDUF599-RNAi 載體利用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞，在添加有卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，28 ℃黑暗生長(zhǎng)2～3 d，挑取單克隆并通過(guò)菌落PCR 進(jìn)行驗(yàn)證。煙草遺傳轉(zhuǎn)化采用葉盤法，受體植物為栽培煙草品種K326，遺傳轉(zhuǎn)化流程具體參照王珊珊等［16］的方法。

1.2.7 NtDUF599 基因沉默效率分析

參照1.2.3 所述方法，提取不同NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系的RNA 并合成第一鏈cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR 儀檢測(cè)不同NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系中NtDUF599 基因的表達(dá)水平，所使用的引物及反應(yīng)步驟如1.2.4 所示。

1.2.8 低溫誘導(dǎo)開花時(shí)間及葉片數(shù)目分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NtDUF599 的低溫誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

為了篩選煙草低溫早花相關(guān)基因，在前期研究中我們對(duì)苗期NC82（低溫早花敏感材料）進(jìn)行了低溫處理，并對(duì)苗期和現(xiàn)蕾期樣品開展了轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到一批與煙草低溫早花可能相關(guān)的候選基因。NtDUF599 即為其中一個(gè)受低溫誘導(dǎo)表達(dá)且在現(xiàn)蕾期也保持較高表達(dá)水平的候選基因（圖1A）。該基因完整ORF 長(zhǎng)度為711 bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白包含236 個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)包含一個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域，目前未發(fā)現(xiàn)該基因功能研究的報(bào)道。為了進(jìn)一步詳細(xì)驗(yàn)證NtDUF599 在低溫條件下的表達(dá)模式，利用實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證了NtDUF599 在苗期低溫條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，NtDUF599 受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，處理后12 h 達(dá)到最高水平。隨后該基因表達(dá)水平逐漸降低，48 h 后趨于穩(wěn)定，但仍為處理前表達(dá)水平的4.5 倍（圖1B）。

圖1 NtDUF599 在低溫條件下的表達(dá)模式Fig.1 Expression pattern of NtDUF599 under chilling treatment

2.2 煙草NtDUF599 基因RNAi 載體構(gòu)建

以K326 的cDNA 為模板，利用NtDUF599 基因特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在靠近200 bp 位置（圖2），與目的片段大小相符。將正向和反向靶序列利用In-Fusion 連接酶依次連接到pBWA(V)HS-RNAi 干擾載體，重組質(zhì)粒送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，所測(cè)得序列與NtDUF599 基因序列100%一致，說(shuō)明靶序列已成功插入到pBWA(V)HS-RNAi載體中，即RNAi 干擾載體構(gòu)建成功。

圖2 NtDUF599 基因片段電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretogram of NtDUF599 gene fragment

2.3 NtDUF599 沉默效果分析

利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得 10 個(gè)NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系，這些株系在正常條件下的生長(zhǎng)發(fā)育表型與K326 相似，如株高、葉片數(shù)、花期等。實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果（圖3）表明，不同NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系中NtDUF599 的表達(dá)水平均降低，說(shuō)明已成功獲得NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙草。各株系下降幅度存在差異，其中，RNAi-4 和RNAi-9 這兩個(gè)株系NtDUF599 的表達(dá)量下降80%左右，說(shuō)明基因沉默效果良好。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選取以上兩個(gè)株系開展低溫早花表型鑒定。

圖3 NtDUF599 在RNAi 轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of NtDUF599 in NtDUF599-RNAi transgenic lines

2.4 NtDUF599 沉默對(duì)煙草低溫早花表型的影響

K326 及NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系（RNAi-4和RNAi-9）苗期遭受低溫處理（12 ℃，10 d），隨后恢復(fù)正常生長(zhǎng)至現(xiàn)蕾期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常條件下生長(zhǎng)的K326 與NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因株系開花時(shí)間和現(xiàn)蕾期葉片數(shù)目均沒(méi)有顯著差異。然而，苗期遭受低溫的NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙株與K326 花期均提前，但NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙株比K326 提前10 d 左右（圖4A）。低溫誘導(dǎo)煙株提前開花的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致葉片數(shù)目減少，葉片數(shù)目也是衡量低溫早花敏感性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，現(xiàn)蕾時(shí)NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙株的葉片數(shù)目顯著小于K326（圖4B），進(jìn)一步說(shuō)明NtDUF599-RNAi轉(zhuǎn)基因煙株遭受低溫后更易早花。

3 討論

在前期RNA-Seq 分析的基礎(chǔ)上，本研究中利用RNAi 干擾技術(shù)鑒定了一個(gè)煙草低溫早花相關(guān)基因NtDUF599，首次揭示植物DUF 基因家族成員參與了煙草低溫開花過(guò)程。

圖4 NtDUF599-RNAi 煙株的低溫早花表型分析Fig.4 Phenotypic analysis of chilling-induced early flowering in NtDUF599-RNAi transgenic plants

DUFs（Domain of unknown functions）是一類數(shù)目龐大的基因家族，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中［17］。已有研究表明，植物DUFs基因家族參與了諸多生物學(xué)過(guò)程，如生長(zhǎng)發(fā)育［18-20］、病蟲害防御反應(yīng)等［21-23］，以上研究大多數(shù)在擬南芥、水稻、玉米等植物中完成，在煙草中DUFs 的研究較少。近年來(lái)，DUFs 參與調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的研究報(bào)道漸多［24-25］，顯示出其在植物抗逆性過(guò)程中的重要功能。水稻DUF1645 家族基因OsSGL 受低溫、干旱、高溫等多逆境誘導(dǎo)表達(dá)，其過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性顯著增強(qiáng)［26］。 沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus) DUF1517 家族基因AmDUF1517 是一個(gè)與冷脅迫相關(guān)的基因，其在擬南芥atduf1517 缺失突變體中超量表達(dá)，能夠恢復(fù)擬南芥突變體的抗低溫能力［27］。煙草Nt92 基因?qū)儆贒UF868 基因家族，表達(dá)數(shù)據(jù)顯示其可能與逆境脅迫應(yīng)答以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)［28］。NtDUF599 不僅受低溫誘導(dǎo)表達(dá)（圖1），而且還參與了對(duì)煙草低溫早花的調(diào)控（圖4）。與K326 相比，苗期低溫會(huì)導(dǎo)致NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙草的花期提前，說(shuō)明該基因在調(diào)控低溫早花過(guò)程中發(fā)揮正向功能。在模式植物擬南芥中，至少存在4條與花期相關(guān)的調(diào)控途徑：春化作用、光周期、赤霉素和自主開花途徑［29-32］。 Li 等［33］研究發(fā)現(xiàn)DUF 家族成員DUF1313 參與了植物光周期調(diào)控，可能與植物的花期控制有關(guān)，目前仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。鑒于NtDUF599 受低溫誘導(dǎo)表達(dá)且與低溫誘導(dǎo)早花有關(guān)，而春化途徑也與低溫和開花途徑聯(lián)系緊密，推測(cè)NtDUF599 參與低溫誘導(dǎo)早花過(guò)程可能與春化途徑有關(guān)。下一步，將利用實(shí)時(shí)定量PCR 或RNA-seq 方法檢測(cè)NtDUF599-RNAi 轉(zhuǎn)基因煙草中春化信號(hào)途徑各基因的表達(dá)水平，創(chuàng)制NtDUF599 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草，從正、反向遺傳學(xué)角度探究NtDUF599 參與低溫誘導(dǎo)早花過(guò)程的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

（1）NtDUF599 基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)；（2）苗期遭受低溫后，NtDUF599 基因沉默煙株花期提前，說(shuō)明該基因在低溫誘導(dǎo)早花過(guò)程中發(fā)揮正向功能；（3）首次發(fā)現(xiàn)植物DUFs 參與了低溫誘導(dǎo)早花過(guò)程。