煙草秸稈廢棄物中纖維素降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

梅金飛，剛利萍，余梅霞，徐華杰，吳福芳，戴 亞，盛良全*

1. 阜陽師范大學(xué)，安徽省阜陽市清河西路100 號 236037

2. 重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，重慶市南岸區(qū)南坪東路2 號 400060

煙草秸稈中含有大量有機物和礦物質(zhì)，其中氮含量0.5%～1.2%，磷含量0.10%～0.25%，鉀含量0.8%～1.8%［1-2］。因此，合理利用煙草秸稈是煙草廢棄物再利用的重點工作之一。目前已篩選出多種微生物菌株用于農(nóng)作物秸稈的降解。鄒芳等［3］從皖南地區(qū)煙稻輪作田土壤中篩選出產(chǎn)纖維素酶活性較高、相對耐熱耐堿且對煙桿有一定分解作用的降解菌YC-2；付麗等［4］以秸稈為唯一碳源從土壤中篩選出3 株具有秸稈降解能力的菌株；Bano 等［5］利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）KIBGE-HAS 降解甘蔗渣生產(chǎn)纖維素降解酶；Dar等［6］從棉鈴蟲腸道中篩選出纖維素降解菌克雷伯菌（Klebsiella sp.）MD21，可用于生物秸稈降解和制漿工業(yè)；Hussain 等［7］從家禽房土壤中分離出產(chǎn)纖維素酶的細菌，將植物秸稈廢棄物降解轉(zhuǎn)化為有利用價值的化合物；楊雪梅等［8］從腐殖質(zhì)中分離出高產(chǎn)漆酶的木質(zhì)素降解菌，其液態(tài)發(fā)酵液對煙秸稈粉末降解30 d 后失重率50%、木質(zhì)素降解率39.39%、纖維素降解率36%。該真菌菌株產(chǎn)酶量高，對烤煙秸稈降解能力較強。王海濱等［9］篩選得到弗留明拜葉林克氏菌（Beijerinckia fluminensis）XM-3 在固態(tài)發(fā)酵20 d 后對苦參殘渣和稻稈的降解率分別達31.4%和63.1%。孫玲等［10］篩選出的黃桿菌（Flavobacterium banpakuense）CMC-I，在固體發(fā)酵10 d 后對玉米秸稈的降解率可達24. 14%。王天生等［11］篩選出的菌株DX-5 和DX-9 按照2∶3 進行組合后的復(fù)合菌系纖維素降解率高達87.96%。在煙草秸稈廢棄物的研究方面，萬兵兵等［12］從煙草根際中篩選出具有解磷釋鉀功能的微生物可用于煙草秸稈的降解；陳興等［13］從陳化煙葉中分離到纖維素（CMC）酶活性較高的菌株CE1，可促進煙葉中纖維素轉(zhuǎn)化為水溶性糖類；Zhang 等［14］從煙草根際中篩選出高效解鉀菌，能夠在固體和液體培養(yǎng)基中溶解鉀長石粉；謝雨歆等［15］從煙草根際土壤中分離篩選出促生性好且相互之間不存在拮抗作用的產(chǎn)吲哚乙酸菌、溶磷菌和解鉀菌。另外，從自然界分離篩選出的菌株產(chǎn)纖維素酶活性普遍較低，纖維素降解菌發(fā)酵條件又直接影響其纖維素酶活性，進而影響菌株對秸稈纖維素的降解。因此優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件尤為必要。郭愛蓮等［16］對產(chǎn)黃纖維單胞菌（Cellulomonas flavigena）的培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基pH、碳氮源等培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，CMC 酶活性可達48.64 U/mL；宋桂經(jīng)等［17］對芽孢桿菌接種量、溫度、培養(yǎng)基初始pH、時間等條件進行優(yōu)化，使酶活性由初篩時的3.4 U/mL 提高到6.0 U/mL；韓學(xué)易等［18］通過對溫度、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)時間、不同的碳源和氮源等對枯草芽孢桿菌進行產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化，產(chǎn)纖維素酶活性由68.5 U/mL 提高到196.33 U/mL；金 迪 等［19］對 貝 萊 斯 芽 孢 桿 菌（Bacillus velezensis）JMD11 進行產(chǎn)纖維素酶條件分析表明，菌株在初始培養(yǎng)基pH 7.0、培養(yǎng)溫度28 ℃發(fā)酵32 h 后，酶活性達260.32 U/mL。但從煙草秸稈中篩選的既能高效降解秸稈纖維素同時又能釋放秸稈中磷與鉀元素的降解菌研究與應(yīng)用尚鮮見報道。為此，進行了煙草秸稈廢棄物中纖維素降解菌的篩選及產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化，旨在為煙草秸稈廢棄物中纖維素的有效降解和秸稈生物有機肥料的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在安徽省阜陽市潁泉區(qū)插花鎮(zhèn)煙葉產(chǎn)區(qū)采集煙草的莖葉，自然堆置3～5 個月，粉碎后保存到無菌袋中備用。對照菌株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）WGS-12 由阜陽師范大學(xué)微生物實驗室提供，以下簡稱WGS-12。

試驗用培養(yǎng)基包括初篩培養(yǎng)基、甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基、羧甲基纖維素酶活（CMCase）培養(yǎng)基、濾紙酶活（FPase）培養(yǎng)基［20］、有機磷固體（液體）培養(yǎng)基、無機磷固體（液體）培養(yǎng)基、解鉀菌分離培養(yǎng)基、解鉀菌發(fā)酵培養(yǎng)基［21］、秸稈液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（煙草秸稈10.0 g/L；（NH4）2SO4，2.0 g/L；K2HPO4，1.0 g/L；KH2PO4，1.0 g/L；MgSO4，0.2 g/L；CaCl2，0.1 g/L；FeSO4，0.05 g/L；MnSO4，0.02 g/L）。

試劑主要有3，5-二硝基水楊酸［98%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司］、酒石酸銻鉀（98.8% 天津博迪化工股份有限公司）、四苯硼酸鈉（AR 99% ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、抗壞血酸（C6H8O6，左旋）（99.7%，天津博迪化工股份有限公司）、羧甲基纖維素鈉（≥99.0%，北京百靈威科技有限公司）、剛果紅（中國遠航試劑廠），其他常規(guī)試劑均為上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化

按照稀釋涂布平板法［22］進行煙草秸稈細菌的分離。取10.00 g 煙草莖葉粉末裝入到已滅菌錐形瓶中，加入100 mL 已滅菌的二次蒸餾水，放在振蕩器中振蕩浸取24 h 后，吸取浸取液并稀釋10倍、100 倍和1 000 倍。吸取稀釋后不同倍數(shù)浸取液，分別在初篩培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)。挑取在初篩培養(yǎng)基上不同形態(tài)菌株至LB 培養(yǎng)基進行分離純化。

1.2.2 高效纖維素降解菌的篩選

挑取對照菌WGS-12 和獲得的單菌落接種在CMC-Na 培養(yǎng)基上，37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)3 d。用剛果紅溶液染色15 min 后，加入氯化鈉溶液漂洗，并測定降解圈直徑與菌落直徑，通過降解圈直徑與菌落直徑的比值大小，比較菌株降解纖維素能力強弱，比值越大說明纖維素降解能力越強［23］。

1.2.3 纖維素酶活性的測定

采用DNS 法［24］測定纖維素酶活性，單位定義為每毫升粗酶液在1 min 內(nèi)催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 個酶活性單位（U）。

1.2.4 解磷釋鉀能力的測定

1.2.4.1 解磷能力的測定

挑取對照菌WGS-12 和目標(biāo)菌株（編號SL-3A）單菌落接種到有機磷（或無機磷）固體培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下培養(yǎng)3 d。觀察解磷圈產(chǎn)生的情況，測量并記錄解磷圈直徑（H）。

挑取對照菌WGS-12 和SL-3A 單菌落接種到50 mL 有機磷（或無機磷）液體培養(yǎng)基中，以不接菌為空白對照，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，37 ℃培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液于10 000 g 離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中有效磷含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［25］。

1.2.4.2 釋鉀能力的測定

將對照菌WGS-12、SL-3A 和大腸桿菌（Escherichia coli）單菌落接種到解鉀菌分離培養(yǎng)基上，放置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，每天觀察，菌株在解鉀菌分離培養(yǎng)基上能生長視為有解鉀活性，即為解鉀菌。

挑取對照菌WGS-12、SL-3A 和大腸桿菌（Escherichia coli）單菌落接種到解鉀菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌為空白對照，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，37 ℃培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液于10 000 g 離心10 min，取上清液，采用四苯硼鈉法測定培養(yǎng)液中有效鉀含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［26］。

1.2.5 菌株鑒定

形態(tài)特征與生理生化特性：LB 平板培養(yǎng)觀察菌落的大小、顏色、表面和邊緣形狀，并對菌體進行革蘭氏染色［27］。

分子生物學(xué)鑒定：菌株送北京睿博生物科技有限公司測序，采用BLASTN 軟件與EZbiocloud網(wǎng)站對SL-3A 菌株的16S rDNA 部分序列進行同源性比對，用MEGA 5.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［21］。

1.2.6 產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

采用單因素試驗考察培養(yǎng)時轉(zhuǎn)速、溫度、菌液接種體積、初始pH、氮源、碳源及碳氮比對菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，并確定較佳發(fā)酵條件［28］。

1.2.7 秸稈降解效果

將純化后的SL-3A 菌株和對照菌WGS-12 接種到LB 液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃條件下振蕩（180 r/min）過夜培養(yǎng)，將其用作秸稈液態(tài)發(fā)酵降解實驗和CMCase 發(fā)酵實驗種子液。

準(zhǔn)確稱取1.00 g 煙草秸稈，按不溶性碳為1%的濃度制備秸稈液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，將SL-3A 和對照菌WGS-12 種子液按8%體積比接種到秸稈液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)15 d，并在第3、6、9、12 和15 d 過濾出發(fā)酵培養(yǎng)基中秸稈，并在105 ℃下烘干至恒質(zhì)量。發(fā)酵前后秸稈質(zhì)量之差即為秸稈降解質(zhì)量，并計算出秸稈降解率。

1.2.8 降解菌劑在秸稈堆肥中的應(yīng)用

參照諸葛誠祥［28］的方法構(gòu)建高效降解菌劑，利用優(yōu)化后的SL-3A 產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件對SL-3A 菌株進行CMCase 發(fā)酵培養(yǎng)，作為自制降解菌劑。將構(gòu)建的自制降解菌劑和外購菌劑（EM 菌液 佛山市南海禪泰動物藥業(yè)有限公司）進行秸稈堆肥試驗，并在堆肥過程中取樣，用元素分析儀（Elementar vario EL cube，德國元素分析系統(tǒng)公司）測定全碳與全氮，參照田維亮等［29］方法測定粗纖維素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。在堆肥開始與結(jié)束后采用Mchlich-3 萃取法進行樣品磷和鉀的提取，分別用鉬銻抗比色法和電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Optima 8000，美國珀金埃爾默股份有限公司）測定有效磷和有效鉀含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［30］。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的初步篩選

從煙草莖葉粉末中初篩得到21 株細菌，將21株細菌純化保存。21 株菌株與對照菌WGS-12 在CMC-Na 培養(yǎng)基都能夠生長，經(jīng)剛果紅染色后均產(chǎn)生明顯的纖維素降解圈，根據(jù)降解圈直徑與菌落直徑的比值大小（圖1），篩選出1 株降解纖維素能力較強菌株，編號為SL-3A，其降解圈直徑與菌落直徑比值為7.67±0.40，對照菌WGS-12 降解圈直徑與菌落直徑比值為3.17±0.54。

圖1 SL-3A 與對照菌WGS-12 的降解能力比較Fig.1 Degradation abilities of SL-3A (left) and the control strain (WGS-12，right)

2.2 纖維素酶活性分析

CMCase 與FPase 酶活性檢測結(jié)果見圖2。加入SL-3A 菌株的發(fā)酵液中CMCase 與FPase 酶活性均隨培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。CMCase 和FPase 酶活性在培養(yǎng)第3 天時達到高峰，分別為96.98 U 和70.43 U，而加入對照菌株的發(fā)酵液中CMCase 與FPase 酶活性在培養(yǎng)第3 天時分別為52.61 U 和24.33 U，因此SL-3A 菌株纖維素酶活性明顯優(yōu)于對照菌WGS-12。

2.3 解磷釋鉀能力分析

2.3.1 解磷能力分析

SL-3A 菌株解磷能力見表1。加入SL-3A 菌株的培養(yǎng)基中有機磷含量為40.54 mg/L，無機磷含量320.88 mg/L。而加入對照菌WGS-12 的培養(yǎng)基中有機磷含量為10.83 mg/L，無機磷含量95.52 mg/L。可見，SL-3A 菌株具有解磷能力且優(yōu)于對照菌WGS-12。

表1 SL-3A 解磷能力分析Tab.1 Ability of SL-3A to dissolve phosphorus

圖2 不同培養(yǎng)時間SL-3A 與對照菌WGS-12 的纖維素酶活性比較Fig.2 Cellulase activities of SL-3A (left) and the control strain (WGS-12，right) at different culture time

2.3.2 解鉀能力分析

按1.2.4.2 中方法將SL-3A 和對照菌WGS-12單菌落接種到解鉀分離培養(yǎng)基上，對照菌WGS-12 和大腸桿菌（Escherichia coli）未見其生長，接種的SL-3A 能生長。說明SL-3A 具有解鉀菌特性。從表2 看出，SL-3A 菌株解鉀能力較強，接種大腸桿菌（Escherichia coli）鉀含量為6.76 mg/L，而對照菌株鉀含量為10.96 mg/L。

表2 SL-3A 解鉀能力分析Tab.2 Ability of SL-3A to release potassium

2.4 菌株鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài)特征與生理生化特性

菌株SL-3A 在培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后，形成的菌落呈梅花狀，表面濕潤光滑，乳黃色，不透明。SL-3A 菌體經(jīng)革蘭氏染色，呈陽性，桿狀或短鏈排列，見圖3。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株SL-3A 的序列長度為873 bp，使用BLASTN 軟件和EZbiocloud 網(wǎng)站對SL-3A 菌株的16S rDNA 部分序列進行同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā) 育 樹，見 圖4。 圖4 顯 示，菌 株SL-3A 的16SrDNA 與枯草芽孢桿菌高度相似。結(jié)合形態(tài)學(xué)和16SrDNA 序列分析，SL-3A 菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A，菌株SL-3A 已保存于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），保藏號為CGMCC No.60629。

圖3 SL-3A 的形態(tài)特征與生理生化特性Fig.3 Morphological characteristics and physiological-biochemical characteristics of SL-3A

圖4 SL-3A 的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree of SL-3A

2.5 SL-3A 產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

2.5.1 搖床轉(zhuǎn)速

在菌株培養(yǎng)過程中，搖床轉(zhuǎn)速的大小會影響菌株與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸，同時還影響著菌株與氧氣的接觸。轉(zhuǎn)速過高與過低都會影響其產(chǎn)纖維素酶效果［28］。隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的增加，此細菌產(chǎn)纖維素酶能力先升高后下降，當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌株SL-3A FPase 與CMCase 達到較高，分別為40.19 U 和126.48 U。表明該菌的適宜產(chǎn)纖維素酶轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.5.2 產(chǎn)酶溫度

在不同溫度的環(huán)境下，菌株的生長和產(chǎn)纖維素酶能力有所不同［28］。SL-3A 在27～60 ℃內(nèi)均可產(chǎn)纖維素酶（圖5），且隨著培養(yǎng)溫度的升高，產(chǎn)纖維素酶能力先上升后下降，當(dāng)溫度為37 ℃時，菌株SL-3A 產(chǎn)纖維素酶能力達較高水平。可見，菌株SL-3A 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的較適宜溫度為37 ℃。

2.5.3 接種體積

接種體積小會造成菌體數(shù)量較少，菌株產(chǎn)纖維素酶量較低;而接種量偏大，菌體數(shù)量過多時會造成營養(yǎng)不足，也限制了菌體的生長，產(chǎn)纖維素酶量也同樣偏低［18］。在接種體積8%時，F(xiàn)Pase 與CMCase 出現(xiàn)最高值，分別為87.76 U 和149.34 U；接種體積為2%時產(chǎn)纖維素酶量出現(xiàn)最低值，F(xiàn)Pase 與CMCas 分別為44.62 U 和92.92 U，因此較佳產(chǎn)纖維素酶接種體積范圍為6%～8%。

2.5.4 初始pH

細菌生長初始的酸堿度會影響其對周圍營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［19］。培養(yǎng)基初始pH 對菌SL-3A 的生長有明顯影響（圖5），初始pH 在5.0～9.0 范圍內(nèi)，菌株生長良好，且宜適生長的初始pH 為7.0。

2.5.5 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源

由圖6 可見，蛋白胨為氮源，F(xiàn)Pase 與CMCase分別達到89.97 U 和150.44 U；（NH4）2SO4為氮源時FPase 與CMCase 為27.65 U 和93.66 U；尿素為氮 源 時，F(xiàn)Pase 與CMCase 可 分 別 達 到23.23 U 和43.51 U。當(dāng)?shù)鞍纂藶榈磿r菌株SL-3A 產(chǎn)纖維素酶能力高于尿素和（NH4）2SO4。因此蛋白胨氮源更為有利。

圖5 SL-3A 產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of cellulase production conditions for SL-3A

圖6 SL-3A 發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of fermentation medium conditions for SL-3A

2.5.6 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源

由圖6 可見，羧甲基纖維素鈉為碳源時，CMCase 與FPase 分別達到154.50 U 和93.66 U；葡萄糖為碳源時，CMCase 與FPase 分別為123.90 U和60.10 U；煙草秸稈為碳源時，CMCase 與FPase分別達到100.65 U 和52.65 U。羧甲基纖維素鈉為碳源的CMCase 與FPase 高于其他兩種碳源。因此羧甲基纖維素鈉碳源更為有利。

2.5.7 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比

由圖6 可見，C/N 為2∶1 時，CMCase 與FPase分 別 達 到169.25 U 和44.99 U；C/N 為1 ∶1時，CMCase 與FPase 分別達到148.97 U 和97.35 U；C/N 為1 ∶2 時，CMCase 與FPase 分 別 達 到133.48 U和112.83 U。C/N 為2∶1 的CMCase 酶活性高于其他兩種碳氮比，因此發(fā)酵培養(yǎng)基C/N 為2 ∶1 更為有利。

2.6 SL-3A 對煙草秸稈的降解效果

圖7 SL-3A 對秸稈的降解效果Fig.7 Degradation effect of SL-3A on tobacco stalks

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)下，對照菌株和SL-3A 菌株對煙草秸稈降解率均有顯著增加，大致趨勢為先快后慢，見圖7。但SL-3A 菌株與對照菌WGS-12 處理煙草秸稈有顯著差異，在液態(tài)發(fā)酵第15 d，對照菌WGS-12 對秸稈降解率為16.84 %，而SL-3A 對秸稈的降解率高達20.85 %。可見SL-3A 對煙草秸稈降解效果明顯優(yōu)于對照菌WGS-12。

2.7 SL-3A 在秸稈堆肥中的應(yīng)用效果

SL-3A 菌劑在煙草秸稈堆肥41 d 后，粗纖維降解率為34.62 %，而外購菌劑粗纖維降解率為28.19 %，見圖8。C/N 初始為17.77，經(jīng)過SL-3A 菌劑41 d 堆肥發(fā)酵后C/N 為14.12，經(jīng)外購菌劑41 d堆肥發(fā)酵后C/N 為15.40。堆肥41 d 后，有效磷含量增加0.13 %，有效鉀含量增加2.12 %。

圖8 秸稈堆肥中粗纖維素含量和碳氮比比較Fig.8 Crude fiber content (left) and carbon nitrogen ratio (right) in tobacco stalk compost

3 結(jié)論

從安徽省阜陽市潁泉區(qū)插花鎮(zhèn)煙葉產(chǎn)區(qū)煙草秸稈中篩選出1 株具有解磷釋鉀功能的纖維素降解菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A。溫度、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)時間、不同碳源、氮源與碳氮比等因素對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A 產(chǎn)纖維素酶有明顯影響。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A 較佳發(fā)酵條件為：羧甲基纖維素鈉為碳源，蛋白胨為氮源，碳氮比為2 ∶1，發(fā)酵時間3 d，溫度37 ℃，初始pH 為7，接種量8 % ，轉(zhuǎn)速200 r/min。優(yōu)化發(fā)酵條件后，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A 產(chǎn)纖維素酶活性由優(yōu)化前的96.98 U 提高至169.25 U，較原始酶活性提高了174.52%。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SL-3A 液態(tài)發(fā)酵15 d 時煙草秸稈的降解率達20.85%。在煙草秸稈初步堆肥試驗中，粗纖維降解率34.62%，有效磷含量增加0.13%，有效鉀含量增加2.12%。