香莢蘭豆中香蘭素葡萄糖苷的提取、分離及表征

楊 峰，黃 申，席高磊，陳芝飛，于國強(qiáng)，付瑜鋒，蔡莉莉，樊新順，趙志偉，李 杰，王小飛，王 東*

1. 河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南省許昌市金葉大道666 號 461000

2. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號 450002

3. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)開區(qū)第三大街8 號 450016

香蘭素又名香草醛（3-甲氧基-4-羥基苯甲醛），是一種具有香莢蘭香氣及濃郁奶香的重要香料，廣泛應(yīng)用于煙草、食品、日化、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域［1-2］。化學(xué)合成香蘭素具有原料來源穩(wěn)定、生產(chǎn)技術(shù)成熟、產(chǎn)品價格較低等優(yōu)點(diǎn)，但同時亦存在產(chǎn)品香氣單一、風(fēng)味易受雜質(zhì)影響等問題［3-4］。當(dāng)前，煙草行業(yè)使用的香蘭素大多為化學(xué)合成香蘭素，與天然香蘭素相比，其在煙草及煙草制品中應(yīng)用時缺乏天然、豐富的香氣韻調(diào)。同時，隨著人們對食品安全問題的日益關(guān)注，天然香蘭素備受青睞，但其供給量不到香蘭素全球需求量的1%［5-6］。

天然香蘭素主要存在于香莢蘭等天然植物中，其在成熟香莢蘭豆中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.5%～3.0%［7-8］。在殺青、發(fā)酵、催熟和干燥等工藝處理前，成熟香莢蘭豆中的香蘭素主要以香蘭素葡萄糖苷的形式存在，隨后其在β-葡萄糖苷水解酶催化作用下水解生成香蘭素［9-12］。近年來，從香莢蘭豆中提取香蘭素葡萄糖苷，再利用外加β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解，已成為獲取高品質(zhì)天然香蘭素的重要途徑。迄今為止，利用β-葡萄糖苷水解酶催化香蘭素葡萄糖苷、獲得天然香蘭素的研究已較為深入［9-15］，但香蘭素葡萄糖苷提取相關(guān)技術(shù)研究鮮有報道。

本研究中，以香莢蘭豆為原料，通過超聲輔助萃取獲得香蘭素葡萄糖苷粗提物，并以超高壓高效液相色譜（UPLC）技術(shù)為檢測手段，以香蘭素葡萄糖苷提取率為指標(biāo)，進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)化，再利用制備高效液相色譜技術(shù)分離得到高品質(zhì)香蘭素葡萄糖苷，旨在建立香莢蘭豆中香蘭素葡萄糖苷的簡單制備方法，為提高天然香蘭素資源開發(fā)利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

新鮮成熟香莢蘭豆購于海南熱帶植物園，置于-80℃冰箱中保存。

無水乙醇（AR，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純，邁瑞達(dá)科技有限公司）；乙酸（AR，濟(jì)寧市中凱新型材料有限公司）；香蘭素葡萄糖苷（色譜純，北京凱森來醫(yī)藥科技有限公司）。

RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；WD-9415C 超聲波清洗儀（北京六一儀器廠）；SHB-IIIA 循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；2545 高效制備液相色譜儀（美國Waters 公司）；Acquity I-Class 超高效液相色譜儀（UPLC，美國Waters 公司）；Avance AMX-400 核磁共振儀（德國Bruker 公司）；FD5-3B 真空冷凍干燥器（美國GOLD-SIM 公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 香蘭素葡萄糖苷粗提物制備

選取新鮮成熟的香莢蘭豆，于低溫冷凍干燥機(jī)中干燥12 h 后粉碎；稱取100 g 香莢蘭豆粉末，置于2 000 mL 燒杯中；加入1 000 mL 無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬筮M(jìn)行超聲萃取，設(shè)置超聲功率100 W，50℃條件下萃取10 min；萃取后過濾，重復(fù)進(jìn)行3次萃取，合并濾液；減壓濃縮，即得到香蘭素葡萄糖苷粗提物。

1.2.2 粗提物中香蘭素葡萄糖苷含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取100.0 mg 香蘭素葡萄糖苷于小燒杯中，加入無水乙醇溶解后于10 mL 容量瓶中定容，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 乙醇溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取0.1、0.2、0.4、0.6 和0.8 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于5 只2 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容，得到5 種質(zhì)量濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 UPLC 檢測

稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）香蘭素葡萄糖苷粗提物于小燒杯中，用少量無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中定容；取樣并用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，對濾液進(jìn)行UPLC 分析。UPLC 分析條件為：

色譜柱：Sunfire C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流動相：0.5%乙酸水溶液（A）∶甲醇（B）=80∶20（體積比，下同）；流速：0.2 mL/min；紫外檢測器（UV）檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：25 ℃。

1.2.3 香蘭素葡萄糖苷粗提物制備工藝優(yōu)化

按照1.2.1 節(jié)方法，選取萃取時間A（5、10、15、20 和25 min）、萃取溫度B（40、50、60、70 和80 ℃）、固液比C（香莢蘭豆粉與乙醇的質(zhì)量比，1∶5、1∶7、1∶10、1∶12 和1∶15）和萃取功率D（80、100、120、140 和160 W）四個因素，以香蘭素葡萄糖苷提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察不同提取因素對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響，確定最佳工藝條件。

1.2.4 香蘭素葡萄糖苷高壓液相分離純化

設(shè)置初始流動相條件和參數(shù)，取50 mg 香蘭素葡萄糖苷粗品上樣進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整流動相梯度、流速等重要參數(shù)，逐步增加上樣量至最大可處理量；經(jīng)過多次條件考察，確定最佳參數(shù)為上樣量200 mg、流速4 mL/min。

采用最佳參數(shù)條件，取200 mg 香蘭素葡萄糖苷粗品并用6 mL 無水乙醇溶解，上樣分離純化。以0.5%乙酸水溶液和甲醇分別為流動相A 和B，檢測波長245 nm，設(shè)定閾值350 mAU，使用自動收集器和多管收集方式進(jìn)行洗脫液的收集。液相色譜條件為：

色譜柱：XBridge@Prep C18OBD 柱（19 mm×150 mm，5 μm）；流動相：0.5%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），二者體積比80∶20；流速：4 mL/min；紫外檢測器（UV）檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：2 mL；柱溫：25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 香蘭素葡萄糖苷粗提物提取率

按照1.2.1 節(jié)方法制備香蘭素葡萄糖苷粗提物，得到香蘭素葡萄糖苷粗提物2.25 g，采用UPLC 測定，則香蘭素葡萄糖苷粗提物中含香蘭素葡萄糖苷1.88 g，提取率為1.88%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、精密度和回收率

對1.2.2 節(jié)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLC 分析，以目標(biāo)物濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及決定系數(shù)；取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測定6 次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），分別以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果顯示，香蘭素葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=77 895 x+6 350.9，決定系數(shù)R2=0.996 7，LOD 和LOQ 分別為0.30 和1.01 μg?？梢?，在0～4 mg/mL 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性良好，方法的靈敏度較高，適合于目標(biāo)物定量分析。

采用1.2.1 節(jié)方法平行制備5 份香蘭素葡萄糖苷粗提物，以相同的色譜條件測定峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算粗提物中香蘭素葡萄糖苷量，由此計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，RSD 為2.25%，說明方法精密度良好。在已知香蘭素葡萄糖苷含量的粗提物樣品中，分別在3 個不同水平下進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，每個水平的樣品進(jìn)行6 次平行測試，并在相同的色譜條件下測定目標(biāo)物峰面積，以外標(biāo)法定量并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，3 個加標(biāo)水平下的平均回收率為92.6%～96.8%，說明方法準(zhǔn)確性較高。

2.3 香蘭素葡萄糖苷的提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

分別以萃取時間、萃取溫度、固液比和萃取功率為考察因素，以香蘭素葡萄糖苷提取率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究不同因素對香蘭素葡萄糖苷提取效果的影響。

2.3.1.1 萃取時間的影響

固定萃取溫度55 ℃、固液比1∶10、萃取功率為100 W，考察不同萃取時間（5、10、15、20 和25 min）對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，隨著萃取時間的延長，香蘭素葡萄糖苷提取率先升高后趨于穩(wěn)定，原因是，隨著萃取時間的延長，植物細(xì)胞中香蘭素葡萄糖苷向溶劑中溶解、擴(kuò)散得越充分，萃取時間超過10 min 后萃取體系達(dá)到平衡。因此，選擇萃取時間10 min。

圖1 萃取時間對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.2 萃取溫度的影響

固定萃取時間10 min、固液比1∶10、萃取功率為100 W，考察不同萃取溫度（40、50、60、70 和80 ℃）對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，隨著萃取溫度的升高，香蘭素葡萄糖苷提取率先升高后趨于穩(wěn)定，在60 ℃時，香蘭素提取率最高，原因是，升高溫度能夠促進(jìn)分子內(nèi)能增加，使擴(kuò)散速率增大，香蘭素葡萄糖苷在溶劑中的擴(kuò)散更快，溶解量也更多，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，香蘭素葡萄糖苷向溶劑中的擴(kuò)散接近平衡，其提取率趨于穩(wěn)定。因此，選擇萃取溫度60 ℃。

圖2 萃取溫度對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.3 固液比的影響

固定萃取溫度60℃、萃取時間10 min、萃取功率100 W，考察不同萃取固液比（1∶5、1∶7、1∶10、1∶12 和1∶15）對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，隨著萃取溶劑無水乙醇用量的增大，香莢蘭豆粉末和溶劑的接觸面積增加，香蘭素葡萄糖苷更易擴(kuò)散到溶劑中，因此固液比增大有利于提高香蘭素葡萄糖苷的提取率。但當(dāng)固液比達(dá)到1∶10 后，隨著萃取溶劑用量的增大，提取率增加不明顯。因此，綜合成本因素，選擇固液比1∶10。

圖3 固液比對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.4 萃取功率的影響

固定萃取溫度60 ℃、萃取時間10 min、固液比1∶10，考察不同萃取功率（80、100、120、140 和160 W）對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，香蘭素葡萄糖苷的提取率隨萃取功率的增加先升高后降低。隨著萃取功率的提高，超聲波產(chǎn)生的空化作用也越大［16］，香莢蘭豆細(xì)胞的破碎程度亦隨之增大，這會促進(jìn)香蘭素葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，進(jìn)而使香蘭素葡萄糖苷的提取率增加。當(dāng)萃取功率達(dá)到140 W 時，提取率達(dá)到最大，為1.69%，繼續(xù)增大萃取功率時，提取率不再增加。因此，選擇萃取功率140 W。

圖4 萃取功率對香蘭素葡萄糖苷提取率的影響Fig.4 Effect of extraction power on extraction rate of vanillin glucoside

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，初步確定香蘭素葡萄糖苷提取的適宜工藝條件為：萃取時間10 min、萃取溫度60 ℃、固液比1∶10、萃取功率140 W。

2.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取時間（A）、萃取溫度（B）、固液比（C）、萃取功率（D）四個因素進(jìn)行三個水平正交試驗(yàn)，并進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表1。由表1 可知：A～D 四個因素的極差分別為0.04%、0.15%、0.21%和0.05%，這些因素對提取率的影響順序?yàn)镃＞B＞D＞A。因此，可確定最優(yōu)水平組合為C3B3D2A2，即超聲輔助溶劑萃取法提取香莢蘭豆中香蘭素葡萄糖苷的最佳工藝條件為：固液比1∶11、萃取溫度65 ℃、萃取時間10 min、萃取功率140 W，萃取3 次。在此條件下進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，3 次試驗(yàn)的香蘭素葡萄糖苷提取率分別為1.88%、1.90%和1.87%，平均值為1.88%，可見，在此條件下萃取試驗(yàn)的重復(fù)性較好，香蘭素葡萄糖苷的得率較高。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of orthogonal test

2.4 香蘭素葡萄糖苷分離純化條件優(yōu)化

以乙酸水溶液和甲醇為流動相，利用制備高效液相色譜技術(shù)對粗提物中香蘭素葡萄糖苷進(jìn)行分離純化。通過改變流動相乙酸水溶液和甲醇之間的比例，考察其對香蘭素葡萄糖苷分離效果的影響，結(jié)果見圖5。

從圖5 可以看出，當(dāng)乙酸水溶液和甲醇體積比為50∶50 時，香蘭素葡萄糖苷與雜質(zhì)未達(dá)到基線分離，且色譜峰形較差。隨著流動相中乙酸水溶液占比的提升，香蘭素葡萄糖苷的分離度增大，色譜峰形變好，當(dāng)流動相中乙酸水溶液和甲醇比例達(dá)到80∶20 時，香蘭素葡萄糖苷基本上達(dá)到基線分離。

圖5 流動相對香蘭素葡萄糖苷分離效果的影響Fig.5 Effect of flow phase on separation of vanillin glucoside

在最佳參數(shù)條件下高壓制備液相色譜的分離純化效果如圖5D 所示，在254 nm 收集波長下檢測到響應(yīng)閾值超過350 mAU 后開始自動進(jìn)行洗脫液收集，最終收集到1 個色譜峰所對應(yīng)的洗脫液。結(jié)果顯示，該洗脫液的色譜峰形單一，通過對收集的洗脫液進(jìn)行濃縮和稱量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過純化后的香蘭素葡萄糖苷的提取率為1.36%。

2.5 結(jié)構(gòu)表征

采用1H NMR 和13C NMR 對分離純化的產(chǎn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以確定是否為香蘭素葡萄糖苷（圖6），結(jié)果見表2。從1H NMR 可以看出，低場處δH9.59 為香蘭素葡萄糖苷醛基氫，δH7.13、7.33 和7.41三組峰為3 個苯環(huán)氫，δH5.12～3.37 五組峰為吡喃葡萄糖單元7 個氫，δH3.77 為甲氧基氫。從13C NMR 可 以 看 出，低 場 處δC195.1 為 醛 基 碳，δC151.5～111.6 為苯環(huán)碳，δC99.9～60.8 為葡萄糖單元六個碳，δC56.2 為甲氧基碳?？梢?，該化合物為目標(biāo)物香蘭素葡萄糖苷。

圖6 香蘭素葡萄糖苷結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural formula of vanillin glucoside

表2 香蘭素葡萄糖苷的NMR 表征結(jié)果Tab.2 NMR characterization of vanillin glucoside

3 結(jié)論

從香莢蘭豆中提取香蘭素葡萄糖苷粗提物的超聲輔助溶劑萃取法最佳工藝為：萃取時間10 min、萃取溫度65 ℃、固液質(zhì)量比1∶11、萃取功率140 W、萃取3 次，在此條件下，香蘭素葡萄糖苷的提取率為1.88%。利用制備高效液相色譜技術(shù)對粗提物中香蘭素葡萄糖苷進(jìn)行了分離純化，當(dāng)流動相乙酸水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%）和甲醇為80∶20（體積比）時，粗提物的色譜分離效果較好，香蘭素葡萄糖苷得率達(dá)到1.36%。采用1H NMR 和13C NMR 對產(chǎn)品進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，所得產(chǎn)品即為目標(biāo)化合物香蘭素葡萄糖苷。本研究中建立的香蘭素葡萄糖苷提取分離方法處理量較大、步驟簡便、成本低廉，可為天然香蘭素葡萄糖苷單體開發(fā)提供參考。