仿生提取法研究螞蟥不同部位體外抗凝活性

王常瞵，劉國飛，向澤棟，董萍萍，趙紅金，高鵬，代龍*

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200)

水蛭是我國名貴中藥材，為水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman和水蛭HirudonipponicaWhitman的干燥全體，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥之功效[1]，臨床多用于消散淤血，治療心血管疾病、血栓性疾病等[2]。其中，螞蟥又名寬體金線蛭，為山東省微山湖地區(qū)的道地藥材，是當前藥材市場流通和臨床應用的主流品種[3]。

水蛭不同部位的抗凝活性具有一定的差異，研究表明水蛭素是從新鮮吸血水蛭唾液腺中分離純化得到的[4]，而螞蟥為非吸血水蛭，其藥效部位與物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，其抗凝的有效成分是否也存在于消化系統(tǒng)中有待驗證，因此研究螞蟥不同部位的抗凝活性具有重要意義。目前水蛭的抗凝活性研究中，研究者大多采用生理鹽水提取，而水蛭的主要成分為蛋白質(zhì)[5-6]，進入體內(nèi)需經(jīng)過胃腸道的消化降解后，才能吸收入血發(fā)揮療效。因此生理鹽水提取的成分與體內(nèi)發(fā)揮療效的活性成分可能完全不同。仿生提取模擬體內(nèi)消化過程，能真實地反映水蛭在體內(nèi)的代謝變化，所得活性成分與藥效物質(zhì)更為接近[7]。

本實驗采用生理鹽水提取和仿生提取法對螞蟥肌肉、內(nèi)臟、吊干品進行提取，以針對不同凝血途徑的凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)以及抗凝血酶活性為指標測定其體外抗凝活性，并進行對比，深入研究螞蟥不同部位的抗凝活性，為尋找螞蟥的藥效部位和物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Xi1000全自動凝血測試儀(北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；H01-1A磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；PHS-25PH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；FD-1A-50凍干機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

1.3 實驗動物

SD大鼠 (濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號:SCXK (魯) 2019-0003),雄性, 體重(200±5)g。

2 實驗方法

2.1 實驗取材

將活體螞蟥用細繩穿起，置于陰涼通風處晾干，即為吊干品，粉碎，過5號篩，備用。將活體螞蟥置于冰塊上解剖，將內(nèi)臟與肌肉分離開，凍干得到螞蟥內(nèi)臟與肌肉凍干粉，粉碎，過5號篩，備用。

2.2 活性成分的提取

2.2.1 生理鹽水提取

取螞蟥吊干品、肌肉、內(nèi)臟粉末，加入10倍量生理鹽水，充分攪拌，浸提30 min，時時振搖，4500 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.2.2 仿生提取

取螞蟥吊干品、肌肉、內(nèi)臟粉末，加入10倍量水，稱重，85 ℃加熱15 min后補足失重，冷卻至40 ℃，用稀鹽酸將pH調(diào)至2.0，加入酶底比為1%的胃蛋白酶，酶解1 h，用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至8.0，加入酶底比為1%的胰蛋白酶，酶解3 h，85 ℃加熱15 min殺酶，然后將酶解液pH調(diào)至7.0，4500 r/min離心10 min，得上清液，沉淀加水洗滌2～3次后4500 r/min離心10 min，得上清液，將所得上清液合并，定容至藥材10倍量體積，作為供試品溶液[8]。

2.3 體外抗凝活性的測定

TT、APTT、PT是反映血液凝固時間的代表性指標，分別體現(xiàn)了三個不同凝血途徑的凝血時間，能夠用來全面地反映藥物的抗凝活力?？鼓富钚詼y定即凝血酶滴定法，為2015年版《中國藥典》水蛭藥材項下的測定指標。

2.3.1 貧血小板血漿(PPP)的制備

2.3.2 凝血酶時間的測定

取270 μL PPP和150 μL 供試品溶液混勻，作為待測血漿，吸取100 μL 待測血漿于測試杯中，37 ℃孵育3 min后，加入100 μL TT試劑，記錄凝固時間，同時以空白溶液為參比溶液。生理鹽水提取樣品以生理鹽水為空白溶液，仿生酶解提取樣品以空白酶解液為空白溶液?？瞻酌附庖喊?.2.2項下仿生提取所述，除不加螞蟥粉末外，其余步驟均相同。

2.3.3 活化部分凝血活酶時間的測定

取300 μL PPP和120 μL 供試品溶液混勻，作為待測血漿，吸取50 μL 待測血漿和50 μL APTT試劑于測試杯中，混勻，37 ℃孵育3 min，加入CaCl2溶液50 μL ，記錄凝固時間，同時以空白溶液為參比溶液。

2.3.4 凝血酶原時間的測定

取300 μL PPP和120 μL 供試品溶液混勻，作為待測血漿，吸取50 μL 待測血漿于測試杯中，混勻，37℃孵育3 min，加入PT試劑100 μL ，記錄凝固時間，同時以空白溶液為參比溶液。

2.3.5 抗凝血酶活性的測定

精密量取供試品溶液100 μL置于試管中，加入含有0.5%纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液200 μL，搖勻，置37 ℃水浴中溫浸5 min，滴加每1 mL中含10單位的凝血酶溶液(每4 min滴加1次，每次2 μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液體積，計算抗凝血酶活性。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 凝血酶時間

螞蟥不同部位生理鹽水提取物和仿生提取物的TT值見表1。

表1 螞蟥不同部位生理鹽水提取物及仿生提取物TT值(n=5)Table 1 TT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 單位：s

在TT所反映的凝血共同途徑中，無論生理鹽水提取還是仿生提取，與空白組相比，螞蟥各部位均能產(chǎn)生較強的抗凝活性(p<0.05)，但是在不同部位抗凝活性對比時，不同提取方法具有一定的差異。采用生理鹽水提取時，內(nèi)臟的TT值明顯高于肌肉和吊干品(p<0.05)，表明內(nèi)臟的抗凝活性大于肌肉和吊干品，這與吳曼郡等[9]的研究結(jié)論一致，推測可能螞蟥內(nèi)臟中也存在水蛭素類似物，能夠很好地抑制凝血酶的活力。而在仿生提取時，內(nèi)臟的抗凝活性較肌肉與吊干品有明顯的降低(p<0.05)，可能是由于水蛭素等抗凝大分子物質(zhì)被降解為小分子，抑制凝血酶的分子及空間結(jié)構(gòu)被破壞，導致抗凝活性降低。吊干品和肌肉在仿生提取時的抗凝活性高于生理鹽水提取，是由于仿生酶解將吊干品和肌肉中的大分子蛋白降解為小分子物質(zhì)，暴露了其中的抗凝活性位點，使其具有一定的抗凝活性。

3.2 活化部分凝血活酶時間

螞蟥不同部位生理鹽水提取物和仿生提取物的APTT值見表2。

表2 螞蟥不同部位生理鹽水提取物及仿生提取物APTT值(n=5)Table 2 APTT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 單位：s

在APTT所反映的內(nèi)源性途徑中，結(jié)果顯示螞蟥各部位仿生提取液的抗凝活性均高于生理鹽水提取液。生理鹽水提取法結(jié)果顯示，螞蟥的內(nèi)臟與肌肉和吊干品相比，能夠顯著延長APTT(p<0.05)，這與TT法的測定結(jié)果一致，這也進一步證實了螞蟥內(nèi)臟中確實存在較強的抗凝活性物質(zhì)，能夠延長TT和APTT。仿生提取法結(jié)果顯示，與TT所得到的結(jié)果不同，螞蟥內(nèi)臟APTT值較高(p<0.05)，可能是由于內(nèi)臟中的大分子蛋白質(zhì)被降解為肽類物質(zhì)，但其中的抗凝氨基酸序列依然存在，對凝血因子Ⅺ、Ⅻ等具有較強的抑制作用，從而起到延長APTT的作用。

3.3 凝血酶原時間

螞蟥不同部位生理鹽水提取物和仿生提取物的PT值見表3。

表3 螞蟥不同部位生理鹽水提取物及仿生提取物PT值(n=5)Table 3 PT indicator for saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n=5) 單位：s

在PT所反映的外源性途徑中，無論生理鹽水提取還是仿生提取，內(nèi)臟、肌肉、吊干品間的差異均較小(p>0.05)，這與蘇斌[10]的研究結(jié)果相一致，表明PT指標在螞蟥體外抗凝活性檢測方面的敏感性較TT和APTT差，只有樣品在較高濃度時才能延長PT。

3.4 抗凝血酶活性

螞蟥不同部位生理鹽水提取物和仿生提取物的抗凝血酶活性見表4。

表4 螞蟥不同部位生理鹽水提取物及仿生提取物抗凝血酶活性(n=3)Table 4 Antithrombin activity of saline extraction and bionic extraction from different parts of Whitmania pigra Whitman (n = 3)

生理鹽水提取結(jié)果顯示螞蟥內(nèi)臟、肌肉、吊干品三者的抗凝血酶活性相同。仿生提取結(jié)果顯示，內(nèi)臟的抗凝血酶活性比吊干品和肌肉的抗凝血酶活性低，這與TT法得到的結(jié)果相吻合。

同時仿生提取法的抗凝血酶活性均大于生理鹽水提取，這表明螞蟥在仿生酶解后抗凝活性顯著增強。凝血酶滴定法反映的是可溶的纖維蛋白原在凝血酶的催化作用下向不溶的纖維蛋白轉(zhuǎn)化的過程，其凝血途徑與TT法類似，但是由于需要滴加過量的凝血酶才能使纖維蛋白原凝固，對于效價相近的藥材，在最后一次凝血酶滴加之后，有的在很短時間內(nèi)就能凝固，而有的需要較長時間凝固，這表明藥材的抗凝血酶活性是不同的，而實驗人員卻認為二者抗凝血酶活性是相同的，導致實驗準確度和靈敏度不足。

4 結(jié)論

本文研究了螞蟥不同部位在生理鹽水提取和仿生提取兩種方法下的體外抗凝活性，由于兩種提取方法得到的活性物質(zhì)不同，導致體外抗凝活性具有一定的差異。采用生理鹽水提取時，在反映凝血共同途徑的TT值和反映凝血內(nèi)源性途徑的APTT值中，內(nèi)臟均大于肌肉和吊干品，推測螞蟥的消化系統(tǒng)中也存在與吸血水蛭類似的水蛭素類物質(zhì)，具有較強的抗凝活性，而在反映凝血外源性途徑的PT值中，三者間沒有顯著性差異。采用仿生提取時，在TT值和抗凝血酶活性實驗中，內(nèi)臟的抗凝活性低于肌肉和吊干品，是由于胃蛋白酶和胰蛋白酶破壞了水蛭素類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，使得凝血酶直接抑制劑——水蛭素類物質(zhì)無法與凝血酶結(jié)合發(fā)揮抗凝活性，而螞蟥肌肉和吊干品由于酶解，暴露出其中的活性位點，具有較強的抗凝活性。在反映凝血內(nèi)源性途徑的APTT值中，內(nèi)臟與肌肉和吊干品相比，具有較強的抗凝活性，在反映凝血外源性途徑的PT值中，各部位抗凝活性沒有顯著性差異。由于仿生提取法模擬了體內(nèi)消化過程，相比傳統(tǒng)的生理鹽水提取具有更高的可信度。

由上述研究可知螞蟥各部位針對不同的凝血途徑，其抗凝活性具有一定的差異，抗凝物質(zhì)基礎(chǔ)較為分散，不僅存在于消化系統(tǒng)中，肌肉也具有很強的抗凝活性，該研究為尋找螞蟥的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效部位提供了依據(jù)。