高壓氧治療對慢性腦缺血大鼠認知功能的影響及其作用機制

周磊，應英，范茂丹，鄭成剛，衣洪杰，劉青樂

慢性腦缺血（chronic cerebral ischemia，CCI）是一種以腦血流灌注不足、腦血流量降低為特征的病理狀態，能夠引起全腦或局部腦組織區域性代謝障礙，常表現為進行性的認知功能缺損[1-4]。軸突生長抑制因子Nogo-A是一種廣泛分布于神經系統的髓鞘蛋白，是維持大腦結構完整和功能穩定的重要調節因子，被認為是迄今發現最強的神經再生抑制物，其表達增強，損傷神經的再生修復能力降低。Nogo-A參與調節脊髓損傷、多發性硬化癥、阿爾茨海默病、外傷性腦出血、癲癇等多種中樞神經系統疾病神經損傷后的病理生理過程，與認知功能關系密切[5-9]。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療能夠改善一氧化碳中毒、缺血性卒中、外傷性腦出血等腦損傷后的認知功能障礙。但HBO治療是否能通過調節Nogo-A蛋白的表達，改善CCI相關認知功能障礙目前鮮有報道。本研究通過模擬CCI病理生理過程，建立CCI大鼠動物模型，評估HBO治療后大鼠學習記憶等認知功能的變化，通過觀察海馬組織神經元結構改變，在分子水平檢測Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平，探討HBO治療是否能夠改善CCI相關認知障礙。

1 研究對象與方法

1.1 實驗材料及分組

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠240只，體質量160±20 g[購于海軍軍醫大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0002]。所有大鼠入組前均采用Morris水迷宮實驗進行為期5 d的適應性訓練，每日2次，剔除連續3 d未能找到隱蔽平臺的大鼠，用備用大鼠補充。

1.1.2 實驗試劑 包括Nogo-A抗體（北京中杉金橋有限公司），β-actin抗體（美國Bioworld公司），BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Pierce公司），組織用RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒（Roche公司），十二烷基硫酸鈉、甘氨酸（武漢谷歌生物有限公司）。

1.1.3 實驗儀器 包括Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司），全自動核酸分離純化系統（Roche公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），動物高壓氧艙（DWC450-1150型）。

1.1.4 實驗分組 根據隨機數字法將大鼠分為假手術組、CCI組、HBO組，每組80只。

1.2 慢性腦缺血模型制備 將CCI組和HBO組大鼠按永久性結扎雙側頸總動脈方法建立CCI模型[10]。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將大鼠取仰臥位固定于動物手術臺中央。取頸部正中切口，分離頸部血管及伴行神經，依次結扎右側頸總動脈近心端、遠心端后離斷血管。再用相同方法離斷左側頸總動脈。建模成功的標志為大鼠出現意識障礙，翻正反射消失。建模不成功或建模過程中死亡的大鼠用備用大鼠重新建模補充。假手術組大鼠在建模時操作方法相同，但僅分離左、右兩側頸總動脈，不結扎、也不離斷頸總動脈。

1.3 治療方法 HBO組大鼠在CCI建模成功蘇醒12 h后進行HBO治療，治療前純氧洗艙10 min，后勻速加壓10 min，艙內壓力達到0.2 MPa，穩壓時間60 min，最后20 min勻速減壓至常壓，每日1次，持續治療28 d。假手術組與CCI組不予治療。

1.4 實驗檢測方法 建模成功后，每組分為4個檢測時間點：7、14、21及28 d，每個時間點20只大鼠，采用Morris水迷宮實驗測定各時間點大鼠學習、記憶能力，檢測前均進行3 d訓練，每天訓練4次，記錄各時間點大鼠逃逸潛伏時間和穿越平臺次數（穿越平臺次數僅取第28天）。建模28 d認知能力評估后處死大鼠，每組隨機選取4只大鼠海馬組織進行HE染色，8只大鼠海馬組織RT-PCR法檢測Nogo-A mRNA表達水平，8只大鼠海馬組織Western blot法檢測Nogo-A蛋白表達水平。

1.4.1 Morris水迷宮實驗 將大鼠放入水中，記錄其在120 s內找到并爬上平臺的時間，超過120 s記錄為120 s，每只大鼠在每個時間點測試2次，取均值作為逃逸潛伏時間測定結果。然后撤出平臺，任選一相同入水點將大鼠放入水中，記錄其在120 s內穿越原平臺位置的次數，僅測試1次。每組大鼠取檢測結果的平均值作為最后的測定結果。

1.4.2 HE染色 腹腔注射10%水合氯醛處死大鼠，斷頭取腦組織進行HE染色。選取海馬組織平面，光學顯微鏡下觀察海馬組織結構和神經元形態變化。

1.4.3 RT-PCR法檢測Nogo-A mRNA表達水平 取大鼠海馬組織，經液氮冷凍后，研缽研磨。加入Tri試劑勻漿后，依次用氯仿、異丙嗪及無水乙醇分離、沉淀、洗滌溶解RNA，以提取總RNA備用。將提取的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，在42 ℃ 30 min、85 ℃5 min條件下用RT試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。以Nogo-A引物（上游引物：5`-AGTCTTGGGAAGGGAAGGATAGTGA-3`，下游引物：5`-CTTTCGGTTGCTGAGGTA-3`）依次在94 ℃ 4 min 1個循環，94 ℃ 30 s、57 ℃30 s、72 ℃ 1 min 35個循環，72 ℃ 6 min條件下，擴增122bp建立PCR反應系。以β-actin為內參，將PCR擴增的產物進行電泳，目的基因Nogo-A mRNA的表達量以Nogo-A/β-actin的比值進行計算。

1.4.4 Western blot法檢測Nogo-A蛋白表達水平 取大鼠海馬組織洗凈，充分裂解、冰浴后，以3000 r/min離心30 min提取總蛋白。采用BCA法對Nogo-A蛋白進行定量。總蛋白經煮沸、上樣、電泳、轉膜、封閉、浸泡、搖床后，分別依次加入Nogo-A抗體及β-actin，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。加入ECL化學發光顯影液，充分顯影。用Image-proplus 6.0圖像程序分析軟件對電泳條帶進行灰度掃描分析，以Nogo-A/β-actin的比值代表Nogo-A蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 使用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間均數比較采用單因素方差分析，當方差分析有統計學差異時，進一步采用SNK-q檢驗進行不同組間的兩兩比較，界值設定為0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 認知能力評估 逃逸潛伏時間比較：三組間7、14、21及28 d各時間點的逃逸潛伏時間整體差異均具有統計學意義（P=0.0062、P=0.0023、P＜0.0001、P＜0.0001）。進一步兩兩比較顯示，CCI組、HBO組各時間點逃逸潛伏時間均較假手術組延長（均P＜0.05），HBO組各時間點逃逸潛伏時間較CCI組縮短（均P＜0.05）（表1）。

穿越平臺次數比較：三組間28 d穿越平臺次數整體差異具有統計學意義（P=0.0015）。進一步兩兩比較顯示，CCI組、HBO組穿越平臺次數較假手術組減少（均P＜0.05），HBO組穿越平臺次數較CCI組增加（P＜0.05）（表1）。

2.2 HE染色 假手術組大鼠海馬組織神經元呈橢圓形，排列整齊，分布均勻，層次清晰，間隙致密，細胞結構正常，形態完整，核膜完整，核仁清晰。與假手術組相比，CCI組、HBO組大鼠海馬組織神經元出現不同程度的損傷，神經元數量減少，排列疏松，間隙增大，層次紊亂，部分神經元出現壞死、凋亡，細胞間質水腫，胞核固縮溶解。HBO組大鼠海馬組織神經元損傷程度較CCI組輕（圖1）。

2.3 Nogo-A mRNA表達水平 大鼠海馬組織Nogo-A mRNA的表達量在假手術組、CCI組、HBO組中分別為0.29±0.02、1.02±0.02、0.67±0.01，CCI組、HBO組Nogo-A mRNA表達水平均較假手術組升高（均P＜0.05），HBO組較CCI組下降（P＜0.05）。

2.4 Nogo-A蛋白表達水平 大鼠海馬組織Nogo-A/β-actin的比值在假手術組、CCI組、HBO組中分別為1.00±0.02、5.28±0.31、3.01±0.17，CCI組、HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A表達水平均較假手術組升高（均P＜0.05）；HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A表達較CCI組下降（P＜0.05）（圖2）。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較

圖1 各組大鼠海馬組織病理變化（HE染色×200）

圖2 各組大鼠海馬組織Nogo-A蛋白表達水平比較

3 討論

慢性腦缺血是以腦組織長期低灌注為特征的臨床綜合征。腦組織長期低灌注造成腦細胞結構和功能改變引起神經元損傷和腦白質病變，最終導致神經退行性病變及認知功能障礙[11-15]。研究發現，CCI相關認知功能障礙的發生與血腦屏障破壞、神經遞質代謝紊亂、炎癥損傷、氧化應激、免疫損傷、線粒體功能障礙、自由基損傷等機制相關[16-17]。如何改善CCI相關的認知功能障礙，逆轉引起認知功能下降的病理生理過程，找到治療認知功能障礙的分子靶點是亟待解決的課題。CCI發生的實質是腦組織因血流低灌注處于長期的缺血缺氧狀態，而高壓氧是治療神經系統缺血缺氧性疾病的重要手段。涂杳然等[18]研究發現，HBO治療能夠通過下調Nogo-A及NgR表達減輕腦水腫，促進神經功能恢復。但高壓氧能否改善慢性腦缺血引起的認知功能障礙的研究報道較少。

Morris水迷宮實驗是常用的評估大鼠認知功能的方法[19]。本研究利用Morris水迷宮實驗觀察CCI大鼠建模后28 d內的認知能力變化及HBO治療的干預作用。研究發現，CCI大鼠在建模3周左右進入慢性腦缺血期[20-21]。本研究中，在建模后4個時間點（7、14、21、28 d），CCI組大鼠均出現不同程度的認知功能下降，且沒有恢復的趨勢。這可能與永久性結扎雙側頸總動脈造成神經系統損傷較重，缺血缺氧狀態一直未改善，隨時間延長，腦細胞發生缺血缺氧損傷甚至壞死有關。同時，還觀察到在上述4個時間點，HBO治療均可以減輕慢性腦缺血導致的認知功能下降，提示HBO治療在CCI后早期干預中改善了腦組織的缺血缺氧狀態，使得部分腦細胞功能得以恢復，從而改善了認知功能。

本研究進一步探索了CCI大鼠海馬組織形態及HBO治療改善CCI大鼠認知功能的分子機制。研究發現，學習、記憶等認知功能下降是CCI的主要表現之一[22-23]。本研究中，大鼠海馬組織HE染色結果提示CCI導致大鼠海馬組織形態改變，結構出現異常，而HBO治療可以減輕這種形態改變，減少神經元壞死或凋亡。

Nogo是Reticulon家族成員，主要編碼Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C 3種蛋白質，廣泛分布于哺乳動物神經系統，在成年后中等強度表達于海馬組織、大腦皮質等區域[24-28]。腦缺血損傷后神經可塑性下降是影響神經功能恢復的重要因素。Nogo-A蛋白在神經系統損傷后，其表達上調，導致神經可塑性下降，再生修復能力降低。史蕙青等[29]研究發現，慢性大腦缺血大鼠海馬組織中Nogo-A表達量在15 d左右達到高峰，之后逐漸下降，但在30 d中仍高于假手術組。這與本研究相似，本研究發現建模28 d，Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平在CCI組、HBO組大鼠海馬組織中均較假手術組明顯升高。提示Nogo-A蛋白可能參與了CCI后認知功能下降的病理過程。同時，本研究還發現，HBO組大鼠海馬組織中Nogo-A mRNA及Nogo-A蛋白的表達水平較CCI組明顯下降。結合海馬組織形態和大鼠認知功能評估結果，提示HBO治療可能通過抑制Nogo-A蛋白的表達，減少海馬組織神經元壞死、凋亡改善CCI大鼠的認知功能。

綜上所述，本研究結果提示HBO治療能夠改善CCI大鼠認知功能，其機制可能與降低CCI大鼠海馬組織中Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白的表達水平相關。這為臨床治療CCI相關認知功能障礙提供了新的思路和治療靶點。但是，本研究由于樣本量較少，未能在各個時間點取大鼠海馬組織進行Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白檢測，未能呈現慢性腦缺血及HBO治療干預后Nogo-A蛋白的動態變化。

【點睛】本研究發現高壓氧治療能夠改善慢性腦缺血大鼠的認知功能，其機制可能與降低海馬組織Nogo-A mRNA、Nogo-A蛋白的表達水平有關。