嗜鹽真菌Aspergillus montevidensis生物特性研究

盧雨欣，楊學英，米 洋，劉開輝,2，鄧百萬,3 *，趙航軻

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西 漢中 723000; 2.陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安 710021; 3.陜西省食藥用菌工程技術研究中心,陜西 漢中 723000)

【研究意義】 我國是鹽堿地大國，在全世界國家的鹽堿地面積中位居第三，且分布廣泛[1-2]。土壤鹽堿化已成為世界農業的主要非生物脅迫源，鹽堿土壤由于高滲透壓、高pH使植物細胞內環境穩態嚴重失調，導致農作物大面積減產甚至絕收，造成了巨大的經濟損失[3-4]。因此，對鹽堿地土壤修復及開發利用具有重要意義。從微生物角度而言，高鹽土壤環境的利用主要包括降低土壤鹽濃度和培育新型耐鹽作物兩個方面[5]，其中通過篩選嗜鹽微生物的耐鹽基因已成為解決高鹽環境問題的重要手段，采用基因工程手段將耐鹽基因導入植物體內，從而獲得耐鹽能力較強的新型生物技術作物[6]。因此嗜鹽微生物在高鹽土壤環境改良利用及農業生產方面具有重要作用。【前人研究進展】嗜鹽微生物由于長期生活在高鹽環境中，具有特殊耐鹽機制[7-10]。但有關嗜鹽微生物耐鹽機制的研究多集中在細菌、放線菌等原核微生物中，對嗜鹽真菌耐鹽機制的研究報道較少[11]。嗜鹽真菌為適應高鹽環境，其相關耐鹽基因必然會在鹽脅迫下進行高效表達[12]，而形態學上的差異則是其對高鹽環境做出的直觀表現[13-14]。如Kuncic等[15]就從形態學角度對嗜鹽真菌Wallemiaspp.響應高鹽誘導進行了研究，發現在高鹽脅迫下其細胞壁顯著增厚，菌絲球大小顯著增加。現階段關于碳源、氮源對微生物生長的影響已經有了一定的研究，且研究發現含碳化合物和含氮物質對嗜鹽真菌的耐鹽可能有影響[16-18]。【本研究切入點】本研究從形態學角度對嗜鹽真菌Aspergillusmontevidensis生物特性進行初步探究。通過研究高鹽環境中不同碳源、不同氮源、不同碳氮比對嗜鹽真菌A.montevidensis生長速度、生物轉化量、菌落形態以及顯微形態特征的影響，對比分析其對嗜鹽真菌耐鹽的影響，初步探究嗜鹽真菌的耐鹽機制。【擬解決的關鍵問題】通過對嗜鹽真菌的生物學特性研究，可進一步從分子水平及生物代謝水平探究嗜鹽真菌的耐鹽機理。同時根據嗜鹽真菌的耐鹽機制，尋找關鍵耐鹽基因，通過轉基因手段培育耐鹽植株，為進一步開發利用嗜鹽真菌資源及解決鹽堿化土壤環境農業生產方面的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 嗜鹽真菌Aspergillusmontevidensis(菌株保藏號：CGMCC3.15762)

1.1.2 培養基配方 PBS緩沖液：Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，K2HPO40.27 g，KCl 0.2 g，加去離子水約800 mL，充分攪拌至試劑完全溶解，調pH至7.4，定容到1 L，121 ℃滅菌25 min后室溫保存。

基礎培養基(1000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4(7H2O 0.5 g，VB110 mg，瓊脂粉18 g，pH 6.5。

供試碳源培養基：以供試碳源替換基礎培養基中的葡萄糖，各組分含量不變，同時分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的供試碳源培養基。供試碳源為：淀粉、纖維素、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖。

供試氮源培養基：以供試氮源替換含最佳碳源的基礎培養基中的蛋白胨，各組分含量不變，同時分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的供試碳源培養基。供試碳源為：硝酸銨、氯化銨、酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀。

供試C/N培養基(1000 mL)：Na2HPO46 g，K2HPO43 g，KNO33.57 g，MgSO4(7H2O 0.12 g，CaCl20.01 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，pH自然。以葡萄糖和KNO3為碳氮源，使培養基中的碳素及氮素質量比分別為10∶1、1∶1、1∶10，同時分別添加0、1.5和3 mol/L的NaCl制成不同鹽濃度梯度的碳氮比培養基。

1.1.3 主要儀器 見表1。

表1 實驗設備與儀器

1.2 實驗方法

1.2.1 菌落形態觀察 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應的培養基中，28 ℃倒置培養7 d，觀察菌落形態，實驗設置3個重復。

1.2.2 顯微形態觀察 采用插片法，在嗜鹽真菌A.montevidensis接種位點旁斜45°插入無菌蓋玻片，待有菌絲爬上蓋玻片后，取出蓋玻片并用棉蘭進行染色，用高級光學顯微鏡進行菌絲、產孢結構等顯微形態的觀察。

1.2.3 菌絲生長速率測量 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應的培養基中，28 ℃倒置培養7 d，每隔24 h測量培養皿中菌落的生長半徑，每種培養基設置3個重復，計算菌絲平均生長速率。

1.2.4 菌絲體干質量測量 將嗜鹽真菌A.montevidensis接種于相應培養基中，28 ℃、150 r/min培養7 d，過濾收集菌絲，用PBS緩沖液反復沖洗3次，60 ℃烘至恒重，進行干質量測量。每種培養基設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

如表2、圖1所示，隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis菌絲生長旺盛，分生孢子鏈更長且更加致密，在1.5 mol/L鹽濃度下其黃色素達到最大沉積，在3 mol/L高鹽濃度下孢子中的色素由黃色轉變為青灰色及黑色，菌絲纖細為白色。在不同碳源中，以蔗糖為唯一碳源時，嗜鹽真菌A.montevidensis最先滿皿，菌絲生長旺盛并有大量孢子產生，且在1.5 mol/L鹽濃度下孢子中的黃色素就已經開始轉變為青灰色及黑色。以葡萄糖為唯一碳源時生長次之。雖然以纖維素為唯一碳源時，孢子色素也較早轉變，但從菌落形態觀察，其并不利于菌絲生長。因此，嗜鹽真菌A.montevidensis的耐鹽性受不同碳源的影響，且以蔗糖為唯一碳源時展現出最好的耐鹽性，且該嗜鹽真菌A.montevidensis的最適生長鹽濃度為1.5 mol/L。

A/a、B/b、C/c、D/d、E/e分別表示以淀粉、纖維素、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖為唯一碳源時，嗜鹽真菌A.montevidensis的菌落形態(顯微形態)；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度A/a,B/b,C/c,D/d and E/e respectively represent the colony morphology (microscopic morphology) of halophilic fungus A.montevidensis when starch,cellulose,maltose,sucrose or glucose are the only carbon sources； 1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

表2 不同碳源對嗜鹽真菌A.montevidensis形態的影響

如圖2所示，不同鹽濃度下嗜鹽真菌A.montevidensis在5種不同碳源的培養基上的生長速率、菌絲體干質量均不同。當NaCl濃度為1.5 mol/L時，以蔗糖為碳源時該菌生長速率最快為0.61 cm/d，菌絲體平均干質量最大為3.00 g/L；當NaCl濃度為3 mol/L時，同樣是以蔗糖為碳源時該菌生長最快，生長速率為0.54 cm/d，菌絲體干質量最大為2.41 g/L。在無鹽條件下時，該菌在不同碳源的培養基上生長速率、生物轉化量差異并不明顯，但隨著鹽濃度的增加，差異明顯，進一步說明了不同碳源對該菌株的耐鹽性存在影響。

圖2 不同碳源下嗜鹽真菌A.montevidensis的生長速率(A)及菌絲體干質量(B)Fig.2 Growth rate (A) and dry weight (B) of halophilic fungus A.montevidensis under different carbon sources

2.2 不同氮源對嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

如表3、圖3所示，隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis分生孢子鏈更長且更加致密，菌絲縱向生長越來越旺盛，甚至3 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在以酵母粉為唯一氮源的培養基上其菌絲已觸及皿蓋。在不同的氮源中，以蛋白胨為唯一氮源時嗜鹽真菌A.montevidensis最先滿皿且產生大量孢子，在1.5 mol/L鹽濃度下孢子中的黃色素就已經開始轉變為青灰色及黑色。從菌落形態觀察，以硝酸銨、氯化銨、酵母粉為唯一氮源時，有利于該嗜鹽真菌在3 mol/L高鹽濃度下菌絲的生長，但不利于其產生孢子。因此，嗜鹽真菌A.montevidensis的耐鹽性也受到不同氮源的影響，在以蛋白胨為唯一氮源時展現出最好的耐鹽性。

A/a、B/b、C/c、D/d、E/e分別表示以硝酸銨、氯化銨、酵母粉、蛋白胨、硝酸鉀為唯一氮源時，嗜鹽真菌A.montevidensis的菌落形態(顯微形態)；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度 A/a,B/b,C/c,D/d and E/e respectively represent the colony morphology (microscopic morphology) of halophilic fungus A.montevidensis when ammonium nitrate,ammonium chloride,yeast powder,peptone or potassium nitrate are the only nitrogen sources；1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

表3 不同氮源對嗜鹽真菌A.montevidensis形態的影響

如圖4所示，在1.5 mol/L鹽濃度下，以蛋白胨為唯一氮源時生長速率最快為0.63 cm/d，菌絲體平均干質量最大為3.05 g/L，酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨次之。在3 mol/L鹽濃度下，仍是以蛋白胨為氮源時菌絲生長速率最快為0.57 cm/d，其菌絲體平均干質量最大為2.56 g/L。氮源種類的不同對嗜鹽真菌A.montevidensis的生長影響較大，且隨著鹽濃度的增加差異較為明顯，進一步說明了不同氮源對該菌株的耐鹽性也存在影響。

圖4 不同氮源下嗜鹽真菌A.montevidensis的生長速率(A)及菌絲體生物量(B)Fig.4 Growth rate (A) and dry weight (B) of halophilic fungus A.montevidensis under different nitrogen sources

2.3 不同C/N對嗜鹽真菌A.montevidensis耐鹽的影響

由圖6可以看出，0 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在不同C/N的培養基中生長狀況良好，在C/N為1∶1和1∶10的培養基上，菌落整體為絨狀，中間呈黃色，邊緣整齊呈白色；在C/N為10∶1的培養基上，菌落表面有乳白色顆粒狀凸起，邊緣處里面呈淺棕色外面為黃色。1.5 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在不同C/N的培養基上菌落形態相似，在C/N為1∶1的培養基上菌落邊緣處出現一圈淺綠色，在C/N為10∶1的培養基上菌落整體更為蓬松，菌絲更加致密，邊緣的綠色比之C/N為1∶1的培養基顏色加深。3 mol/L鹽濃度下，嗜鹽真菌A.montevidensis在C/N為10∶1的培養基中生長狀況最好，菌落整體呈藍綠色；1∶10的培養基上該菌生長次之，菌絲呈淺綠色；在1∶1的培養基上菌絲呈白色，且僅呈現為萌發狀態。由此可見，C/N為10∶1的培養基是嗜鹽真菌A.montevidensis的最佳C/N培養基。

選取最優C/N=10∶1，觀察其在0、1.5、3 mol/L鹽濃度下的顯微形態如圖6所示。0 mol/L鹽濃度下有大量成熟的閉囊殼結構，大小約為44.51～65.74 μm × 46.98～70.72 μm；1.5和3 mol/L鹽濃度下，顯微形態差別并不顯著，均存在分生孢子頭和閉囊殼兩種結構，其閉囊殼大小約為32.09～42.26 μm × 36.00～47.04 μm，但1.5 mol/L鹽濃度下的菌絲及閉囊殼結構多于3 mol/L。說明隨著鹽濃度的增加，嗜鹽真菌A.montevidensis其繁殖方式從以閉囊殼為主的有性繁殖轉變為以分生孢子為主的無性繁殖。

A、B、C分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度A,B and C respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L

3 討 論

通過對嗜鹽真菌A.montevidensis生物特性的初步探究，結果表明：嗜鹽真菌A.montevidensis在鹽濃度為1.5 mol/L，以蔗糖為碳源、以蛋白胨為氮源的培養基上生長狀況最好，此條件下平均生長速率為0.63 cm/d，菌絲體干質量達3.05 g/L。嗜鹽真菌A.montevidensis生長最佳C/N為10∶1。董秀黃等[19]人曾利用蔗糖作為碳源從新疆哈密南湖分離得到最多的嗜鹽菌；王艷紅[20]等人通過對中度嗜鹽菌HalobacillusY5的研究，發現其生長最適碳源為蔗糖，最適氮源為蛋白胨。說明蔗糖與蛋白胨能使嗜鹽菌在鹽脅迫條件下更好的生存，與本研究結果一致。

嗜鹽真菌通過調節復雜的生命活動過程，繼而為適應高鹽環境的響應策略在形態學上的表現也有所不同[15,21]。本研究中的嗜鹽真菌A.montevidensis，在不同碳氮源條件下，當嗜鹽真菌A.montevidensis菌落變為青灰色或黑色，菌絲生長旺盛，分生孢子鏈長且致密時，展現出更好的耐鹽性。在無鹽條件下，以產生閉囊殼結構為主，而在高鹽環境中會以產生分生孢子為主。

本研究通過對嗜鹽真菌A.montevidensis最佳鹽濃度以及碳氮源篩選，結合形態學特征對該菌生物學特性進行初步研究。為進一步全面揭示該嗜鹽真菌耐鹽機制提供參考，同時為耐鹽基因的篩選及耐鹽農作物培育提供了理論依據，為高鹽環境土壤結構改良及開發利用，以促進農業發展奠定了基礎。

A、B、C表示的C/N分別為1∶10、1∶1、10∶1；1、2、3分別代表0、1.5、3 mol/L鹽濃度C/N respectively represented by A,B and C are 1∶10,1∶1 and 10∶1; 1,2 and 3 respectively represent the salt concentration of 0,1.5 and 3 mol/L