低溫脅迫對3種綠絨蒿幼苗葉綠素熒光特性的影響

黃 鴻，屈 燕，侯禎丹，嚴朋飛，劉 建

(西南林業大學園林園藝學院/國家林業局風景園林工程技術研究中心,云南 昆明 650224)

【研究意義】葉綠素是光合作用過程中用于捕獲光能的主要色素，當PSⅡ反應中心葉綠素 P680 的一個電子被激發到高能量的激發態時，會開始電子傳遞過程[1]。葉綠素熒光分析技術已廣泛應用于植物抗逆生理的研究，它具有快速、準確、靈敏、無損傷的特性，可以在保持植株完整的基礎上測定出植株的光合作用過程的變化[2]。通常植物受到脅迫后的生理分析只能滿足少量樣品的研究，但由于受脅迫癥狀常是寒害的晚期表現，所以只單一的通過生理指標評價低溫對植物的影響是較為困難的。而葉綠素在光合作用中產生的熒光信號對低溫造成的細胞傷害較為敏感，同時包含著豐富信息，且不具有破壞性[3]。在低溫下植物的抗寒性指標參數與葉綠素熒光參數的變化有一定相關性，通過測定和分析植物葉片的熒光參數的變化，可以更加快速準確地對植物抗寒性能力及受傷害的程度作出評價。【前人研究進展】一些研究發現低溫會降低植物對光能的利用率，主要表現為光合速率、電子傳遞率、光合酶活性都會明顯降低[4]。在低溫脅迫下，植物會調節自身熱耗散等一系列方式來保護光合機構免受破壞，PSⅡ反應中心可能會發生失活，這種失活分為可逆和不可逆2種[5]。植物在受到嚴重低溫傷害時，可能會對PSⅡ反應中心產生不可逆失活，對光和機構產生嚴重傷害，PSⅡ反應中心是反映植物光化學反應的重要氣管單位，PSⅡ的光化學效率參數能有效地反映植物光化學反映狀況[6]。Fv/Fm是PSⅡ光系統中的最大光化學效率，可以直接、準確反映植物的光化學利用率，是評價植物是否受到光抑制的敏感指標[7]。在環境脅迫中，不同的植物的葉綠素熒光參數的變化也不相同，但大多數研究中，植物的PSⅡ的光化學量子產量Y(Ⅱ)、光化學淬滅和非光化學淬滅、電子傳遞速率等都會有上升或下降的變化[8]。低溫通常是限制植物的生長和地域分配的關鍵因素[9]。低溫脅迫不僅會影響植物生長形態，還會發生植物生理生化反應，傷害植物細胞結構，導致植物光合作用減弱[10]，當溫度降至引起冷害的臨界點，植物光合酶活性、光合電子傳遞速率下降[11]，光合作用會表現出明顯的抑制作用[12]。王賀等[13]研究發現低溫導致蘋果最大光化學量子產量(Fv/Fm)降低，從而使葉片光合機制受阻。梁芳[14]等通過葉綠素熒光技術研究發現，菊花幼苗隨低溫脅迫程度的延長，光化學量子產量Y(Ⅱ)、電子傳遞速率ETR和Fv/Fm呈降低趨勢。在一定脅迫程度下，植物會通過能量耗散途徑等多種調節反應來保護光合機構收到破壞[15]。馬博英等[16]通過研究植物的PSII實際光量子效率Y(II)、光合電子傳遞速率(ETR)和非光化學猝滅系數(NPQ)等葉綠素熒光參數，篩選出抗寒能力強的基因型草坪草。植物受嚴重低溫脅迫時，可能對光合機構產生不可逆的破壞[17]，影響光合電子傳遞和與暗反應有關的酶活性。陳曦等[18]發現0 ℃以下的低溫脅迫對油松造成不可恢復的光合機構損傷。【本研究切入點】綠絨蒿常生長在海拔3000～5000 m高山草甸或者溫差大、氣溫低、空氣稀薄的高海拔地區的流石灘。其幼苗生長過程中必須忍受高山寒冷多變的氣候特征。因此，綠絨蒿是研究高山植物在低溫脅迫下的葉綠素熒光變化規律的理想材料。由于不同種類的綠絨蒿在生理適應性上存在明顯差異。有學者通過對生長在海拔3000 m以上的總狀綠絨蒿和全緣葉綠絨蒿的光合響應進行比較分析，發現在低溫下全緣葉綠絨蒿的光合效率有明顯下降，總狀綠絨蒿對低溫和強光有較強的適應能力，能在光抑制下迅速恢復，這可能是因為總狀綠絨蒿葉片表面著生有細密絨刺能有效減輕強光的刺激。總狀綠絨蒿在強光下會通過調節葉片比葉重、CO2導度來適應強光，較全緣葉綠絨蒿更適合在低海拔地區引種栽培[14]。【擬解決的關鍵問題】文章分別選取貝利葉綠絨蒿(Meconopsisbaileyi),多刺綠絨蒿(Meconopsishorridula)和高莖綠絨蒿(Meconopsissuperba)3種綠絨蒿幼苗，利用葉綠素熒光分析技術，對低溫脅迫條件下3種綠絨蒿幼苗葉綠素熒光特性的變化進行研究，以此來探討低溫脅迫對不同亞屬綠絨蒿幼苗葉綠素熒光特性的影響，為綠絨蒿屬植物的引種栽培、以及高山植物抗寒因子研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及實驗設計

試驗材料為多刺綠絨蒿、高莖綠絨蒿、貝利葉綠絨蒿半年生實生苗。選取大小一致、長勢良好的綠絨蒿幼苗置于人工氣候箱中，先于20 ℃/16 ℃(晝/夜)適應培養2 d，每天光照12 h，然后以4 ℃/h降溫至4 ℃進行低溫脅迫處理，分別在0 h(CK)、低溫處理12、24、48、72 h、恢復48 h時進行葉綠素熒光測定。

1.2 測定方法及指標

取2片暗適應20 min的綠絨蒿幼苗葉片，采用IMAGING-PAM(德國WALZ公司)葉綠素熒光測定儀進行葉綠素熒光參數測定。儀器基本參數：檢測光強度0.1 μmol/m·s，光化光強度81 μmol/m·s，飽和脈沖強度2700 μmol/m·s，脈沖光0.8 s，每隔20 s打開1次。

1.3 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 13.0統計分析軟件進行數據分析，各參數數值為3次重復的平均值。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下幼苗最大熒光(Fm)變化

由圖1可見，隨著低溫脅迫時間的延長，3種綠絨蒿的最大熒光(Fm)均有下降趨勢，在72 h時Fm達到最低值，其中多刺綠絨蒿下降幅度最明顯，比脅迫前下降了30 %。在脅迫24、48、72 h后，貝利葉綠絨蒿最大熒光Fm分別比0 h(CK)下降8.9 %、11.1 %、15.6 %；多刺綠絨蒿分別比0 h(CK)下降 4.6 %、13.9 %、30 %；高莖綠絨蒿分別比0 h(CK)下降2.1 %、11.2 %、16.1 %。經過常溫48 h的恢復，3種幼苗的Fm均有上升趨勢，但未恢復到0 h(CK)水平。

同一品種上不同小寫字母表示差異達5 %顯著水平。下同Different lowercase letters on the same breed indicate that the difference reaches a significant level of 5 %.The same as below

2.2 低溫脅迫下幼苗的表現電子傳遞速率變化

由圖2可見，低溫脅迫處理期間，多刺和高莖綠絨蒿幼苗表觀電子傳遞速率(ETR)隨脅迫時間逐漸下降，貝利葉綠絨蒿ETR在24 h升高，繼而開始下降；多刺綠絨蒿在48 h降至最低然后在72 h升高。貝利葉綠絨蒿、多刺綠絨蒿和高莖綠絨蒿的ETR在72 h下降，分別為0 h(CK)的88 %、45 %和89 %。經過48 h自然恢復，3種幼苗的ETR有所回升。

圖2 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的表現電子傳遞速率變化Fig.2 Changes of the expression electron transfer rate of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.3 低溫脅迫下幼苗的非光化學淬滅變化

由圖3可見，低溫脅迫處理期間，3種綠絨蒿幼苗的非光化學淬滅(NPQ)先上升后下降，均在恢復48 h后升高，貝利葉和多刺綠絨蒿達到最大值。自然恢復48 h后，高莖綠絨蒿的NPQ保持穩定，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿有所上升，2種幼苗(NPQ)均顯著高于0 h(CK)。

圖3 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的非光化學淬滅變化Fig.3 Changes of Non-photochemical quenching of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.4 低溫脅迫下幼苗PSⅡ實際光量子效率變化

由圖4可見，低溫脅迫處理期間，3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ實際光量子效率Y(Ⅱ)逐漸降低，均在72 h達到最小值且顯著小于0 h(CK，P<0.05)，分別為0 h(CK)的84 %、66 %、82 %。經過48 h自然恢復，3種綠絨蒿的Y(Ⅱ)均有所回升，但仍然低于0 h(CK)。

圖4 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗PSⅡ實際光量子效率變化Fig.4 Changes of PSⅡactual light quantum efficiency of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.5 低溫脅迫下幼苗的PSⅡ調節性能量耗散變化

由圖5可見，低溫脅迫處理期間，3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ調節性能量耗散Y(NPQ)在脅迫24 h時升高，其中多刺綠絨蒿在24 h達到最大值。貝利葉綠絨蒿在24、48、72 h的Y(NPQ)與0 h(CK)差異不顯著，經過48 h恢復顯著高于0 h(CK)水平。多刺和高莖綠絨蒿在脅迫24 h后幼苗的PSⅡ調節性能量耗散Y(NPQ)均有不同幅度的下降。

圖5 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ調節性能量耗散變化Fig.5 Changes of PSⅡregulatory in energy dissip of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.6 低溫脅迫下幼苗的PSⅡ非調節性能量耗散變化

由圖6可見，低溫脅迫處理期間，3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ非調節性能量耗散Y(NO)逐漸上升，其中貝利葉和多刺綠絨蒿在48 h達到最大值，且顯著大于0 h(CK，P<0.05)，高莖綠絨蒿在72 h時達到最大值。經過48 h恢復3種絨蒿比較0 h(CK)均有回升，多刺綠絨蒿上升幅度最為明顯。

圖6 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ非調節性能量耗散Fig.6 Changes of PSⅡregulatory energy dissipation of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.7 低溫脅迫下幼苗的PSⅡ潛在活性的變化

由圖7可見，低溫脅迫處理期間，3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ潛在活性(Fv/F0)呈下降趨勢，其中3種綠絨蒿在72 h達到最小值，且顯著低于0 h(CK，P<0.05)，說明低溫影響了PSⅡ受體的電子傳遞。高莖綠絨蒿的PSⅡ潛在活性(Fv/F0)較低溫脅迫前有下降但并無太大變化，說明受低溫傷害相對較小。經過48 h恢復，3種綠絨蒿的PSⅡ潛在活性均有回升。

2.8 低溫脅迫下8幼苗的PSⅡ最大光化學效率的變化

由圖8可見，經低溫脅迫72 h后，多刺綠絨蒿的最大光化學效率Fv/Fm的值顯著低于0 h(CK) (P<0.05)，脅迫72 h較脅迫前降低了36.2 %。在脅迫24 h貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿的最大光化學效率Fv/Fm分別0 h(CK)降低了13.2 %，15.6%，并隨著脅迫時間延長緩慢下降。在恢復48 h后，3種綠絨蒿的Fv/Fm均有升高，但仍未恢復至0 h(CK)水平。這表明3種綠絨蒿幼苗都受到低溫的影響并對低溫具有較強的適應力，其中，多刺綠絨蒿葉片受低溫脅迫的影響，在脅迫72 h時光能利用率最低，但在恢復48 h后，其最大光化學效率有顯著升高，說明多刺綠絨蒿在72 h受到低溫傷害，但又能在溫度恢復之后通過自我調節來抵御傷害。

圖 7 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ潛在活性的變化Fig.7 Changes of PSⅡ potential activity of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

圖8 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗的PSⅡ最大光化學效率的變化Fig.8 Changes of maximum photochemical efficiency of PSⅡ of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

3 討 論

低溫脅迫對植物熒光特性的影響與植物種類有關，不同種類具有一定差異。本試驗研究結果表明，3種綠絨蒿在低溫脅迫下，PSⅡ的電子傳遞速率受到影響都發生了不同程度的光抑制。在低溫脅迫后3種綠絨蒿最大光化學效率(Fv/Fm)、光合電子傳遞量子效率ΦPSⅡ、光化學猝滅qP均顯著降低,非光化學猝滅qN升高，電子傳遞速率(ETR)減慢,導致實際光化學量子產量(Y)下降，與低溫脅迫對其他植物影響的類似研究結果相一致[19]。

3.1 低溫脅迫下3種綠絨蒿的熒光特性

本研究中，隨著低溫脅迫時間的延長，3種綠絨蒿的最大熒光Fm均有下降趨勢，在低溫脅迫72 h時Fm達到最低值，說明PSⅡ的電子傳遞受阻并受到光抑制[20]，其中多刺綠絨蒿下降幅度最明顯。經過常溫48 h的恢復，3種綠絨蒿幼苗的Fm均有上升趨勢，仍未恢復到0 h時的水平。貝利葉綠絨蒿在不同脅迫時間電子傳遞速率ETR和光化學量子產量Y(Ⅱ)值較高，說明在低溫下其光合電子傳遞速率較高[21]。高莖綠絨蒿的非光合效率和調節性熱耗散量子產額的值隨著脅迫時間延長有明顯上升，表明高莖綠絨蒿相較貝利葉和多刺綠絨蒿來說對寒冷的敏感度不高，在低溫下有較強的自我保護能力。低溫脅迫后多刺綠絨蒿的電子傳遞速率ETR和光化學量子產量Y(Ⅱ)降幅大，自然恢復相對緩慢，常溫恢復后Y(NO)仍和0 h時差異不顯著，表明了多刺綠絨蒿在一定程度上對低溫的適應力要弱一些。

3.2 低溫脅迫對3種綠絨蒿光化學能量轉換的影響

NPQ是植物對光合機構的一種自我保護機制，表示在PSⅡ電子傳遞中熱耗散的程度[22-24]。3種綠絨蒿幼苗的非光化學淬滅系數NPQ先上升后下降，均在恢復48 h又上升并達到最大值。表明3種綠絨蒿都在低溫脅迫下通過熱耗散來減輕PSⅡ的損傷。脅迫72 h時3種綠絨蒿的NPQ值均有下降趨勢，表明PSII熱耗散的保護能力隨著低溫脅迫時間延長而有所減弱。溫度恢復48 h后，高莖綠絨蒿的NPQ保持穩定，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿有所上升。

非調節性能量耗散Y(NO)是光損傷的重要指標[25]，Y(NO)值較高表示光化學能量轉換和熱耗散不能將植物所吸收的光完全消耗[26]。3種綠絨蒿幼苗的Y(NO)隨著低溫脅迫時間延長逐漸上升，在脅迫48 h時，均大于0 h時，說明此時3種綠絨蒿幼苗光和機構可能已經受到了損傷[27]。經過48 h恢復，3種綠絨蒿Y(NO)均高于0 h時水平。PSⅡ最大光化學效率Fv/Fm反映PSII光合反應下最大光能轉換效率，能檢測植物在自然環境下是否受到光抑制或其他脅迫。在本研究中，在低溫脅迫下，3種綠絨蒿的最大光化學效率Fv/Fm的值均有所下降，即表明產生了不同程度光抑制，其中多刺綠絨蒿在脅迫72 h時下降幅度最大，光能利用率最低，其葉片受低溫脅迫的影響較大。

4 結 論

對3種綠絨蒿幼苗的Fm、ETR、NPQ、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、Fv/F0和Fv/Fm等一系列熒光參數進行比較，持續低溫脅迫下，貝利葉綠絨蒿ETR和Y(II)值隨脅迫時間延長下降幅度較小且在溫度恢復48 h后有明顯上升，高莖綠絨蒿的NPQ和Y(NPQ)值在低溫脅迫下上升得較快，相較于多刺有較好的低溫自我保護。多刺綠絨蒿的電子傳遞速率ETR和光化學量子產量Y(Ⅱ)降幅大，自然恢復相對緩慢，常溫恢復后Y(NO)和0 h時差異不顯著，表明多刺綠絨蒿在一定程度上對低溫的適應力要弱一些。