野蠶豆根根腐病原菌、生物學特性及其有效殺菌劑研究

孔 瓊，袁盛勇，郭建偉，周銀麗，薛春麗，李 珣，羅武華

(紅河學院生命科學與技術學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】野蠶豆根(CentrantheragrandifloraBenth)又名大花胡麻草、化血丹，是玄參科(Scrophulariaceae)胡麻草屬(Centranthera)多年生植物，分布海拔為500～1400 m的熱帶和亞熱帶地區，如越南、緬甸、印度，中國貴州、廣西、云南等地，其中云南的文山、紅河和屏邊等地都有分布[1]。全草均可入藥，其中根部入藥較為普遍，具有散瘀止血、消腫止痛、活血調經等功效，在云南紅河州等地主要用于心血管疾病的防治[2-3]。【前人研究進展】雖然該藥主要是民間苗族用藥，但隨著國內外消費市場的需求，已經供不應求。自2014年以來，在云南屏邊已有野蠶豆根人工栽培的成功案例，隨著種植面積擴大和種植年限延長，多種病害也伴隨而來。目前國內外對野蠶豆根的研究僅限于民間用藥、化學成分、藥效等方面[4-6]，有關病害種類、病原菌及防治方法均無相關報道。【本研究切入點】筆者于2015-2017年在云南屏邊野蠶豆根種植基地田間調查發現，該藥材在種植過程中常伴有白粉、霜霉、黑斑和根腐病害的發生，其中根腐病極為嚴重，對野蠶豆根的產量和品質造成了嚴重危害。【擬解決的關鍵問題】為了指導野蠶豆根田間種植中的病害防治，在云南野蠶豆根主栽培區屏邊縣采集根腐病害樣品，進行病原菌分離和鑒定，研究了病原菌的生物學特性，并對多種藥劑進行室內測定，以期為該病害的田間防治提供理論依據和方法。

1 材料與方法

1.1 病原菌鑒定

采用組織分離法進行病原菌分離，并用柯赫氏法則進行致病性驗證[7]。純化后的菌種，參照《植物病原真菌學》[8]和《鐮刀菌屬》[9]進行種類鑒定。

1.2 病原菌生物學特性研究

采用在PSA平板上培養5 d的菌種進行下列實驗，其菌絲塊大小為5 mm×5 mm；培養條件為27 ℃恒溫暗培養(1.2.3和1.2.5除外)；培養基為PSA平板(1.2.1和1.2.2除外)。菌落直徑采用十字交叉法測定；產孢量測定：切取培養后4 mm×4 mm菌絲塊1塊，用2 mL無菌蒸餾水稀釋，用血球計數板計量產孢量。試驗數據用DPSv7.05進行方差分析，再用Duncan法進行多重比較，數值表示為平均值±標準差。

1.2.1 不同培養基對根腐病病原菌落生長及產孢量影響 將菌絲塊分別接入3種不同培養基(表2)，后置于27 ℃恒溫暗培養，5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.2 不同碳氮源對根腐病病原菌落生長及產孢量的影響 以Czapek培養基為基本培養基，分別用30 g葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，配制成含不同碳源的培養基；同時分別用2 g的硝酸鉀、尿素、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，配制成不同氮源的培養基。在上述不同培養基中接入菌絲塊，每個處理3次重復，5 d后測定菌落直徑和產孢量。

1.2.3 溫度對根腐病原孢子致死溫度、菌絲生長和產孢量的影響 菌絲生長溫度范圍：將菌絲塊接種于PSA平板中央，于5、10、15、20、25、30、35 ℃溫箱中暗培養，每個處理重復3次，5 d后測量菌落直徑和產孢量。

孢子致死溫度：將配成的孢子懸浮液放入玻璃試管中于溫度為40、45、50、55、60 ℃的水浴鍋內處理10 min，分別取1 滴孢子懸液于凹玻片上，快速風干后于27 ℃恒溫保濕暗培養24 h后觀察孢子萌發情況。根據試驗的具體情況，進一步按l ℃梯度設計溫度，最終確定孢子的致死溫度。

1.2.4 pH對根腐病病原菌絲生長及產孢量的影響 用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH將滅菌后的PSA平板pH值調為5、6、7、8、9、10、11、12，并在平板中央接入菌絲塊，每個處理重復3次，5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.5 光周期對根腐病病原菌絲生長及產孢量的影響 菌絲塊接入PSA平板中央，置于全光照、光暗交替(L/D=12 h/12h)、和全黑暗條件下進行恒溫培養，5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.6 不同濕度對根腐病病原菌分生孢子萌發的影響 參考方中達的《植病研究方法》中小容器空氣濕度調節的方法[7]。在密閉容器中將相對濕度分別恒定在50 %、65 %、75 %、90 %和100 %，取1滴孢子懸液于無菌玻片上，快速風干后于不同濕度下25 ℃恒溫暗培養24 h，統計孢子萌發率，每個處理3次重復。

1.3 室內藥劑篩選

將10種殺菌劑(表1)配制成含不同濃度的含藥固體PSA平板，接入菌絲塊，7 d后測量菌落直徑，設不含藥PSA為空白對照，3次重復，計算相對抑制率。

表1 10種供試藥劑

相對抑制率(%)=[(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)÷對照菌落生長直徑]×100[10]所得經Finney幾率分析法和DPS統計軟件進行數據處理，求出各殺菌劑的毒力回歸方程、EC50及相關系數(r)。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

根腐病發生后，地上植株表現為萎蔫，最終枯死；地下根部變色，腐爛，無臭味。將分離后的菌種經柯赫氏法則驗證后，證明編號為YCD-7菌種是引起野蠶豆根根腐的病原菌。該菌在PSA平板上生長迅速，氣生菌絲薄絨狀，淺灰色至淡藍色，間有蒼綠色的分生孢子座，初看像青霉菌污染(圖1-A)；小型分生孢子多，呈卵圓形或腎形，無隔或偶有1隔，大小為10～20 μm×3.7～5 μm。大型分生孢子馬特形，壁厚，3～5隔，大小為27～50 μm×3.5～5.7 μm(圖1-B)；產孢細胞在菌絲上形成長筒形單瓶梗，少分枝，大小為62～200 μm×3～4 μm(圖1-C)；大米培養物為玫紅色(圖1-D)。根據《植物病原真菌學》和《鐮刀菌屬》將該致病菌鑒定為茄病鐮孢藍色變種[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。

A：菌落形態；B：大、小型分生孢子；C：產孢結構； D：培養物在米飯培養基上的色澤 A: Colony morphology on PSA medium; B: Microconidia and macroconidia; C: Sporogenous structure; D: Color of pathogen on rice medium

2.2 病原菌生物學特性研究

2.2.1 不同培養基對根腐病病原菌絲生長和產孢量影響 不同基本培養基對野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長和產孢量具有不同的影響(表2)。其中查氏培養基上的菌絲生長最快，菌落直徑最大，但與PSA和PDA的處理差異不顯著；而在PSA平板上的產孢量最大，為(2.86±0.03)× 107個/mL，與其他2種培養基的處理差異顯著。因此，PSA培養基適合野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍色變種菌絲生長和產孢量的增加。

表2 不同培養基對根腐病病原菌菌絲生長和產孢量的影響

2.2.2 不同碳氮源對根腐病病原菌絲生長和產孢量影響 在供試的4種碳源中，以葡萄糖為碳源的培養基菌絲生長最快(表3)，菌落直徑最大為(7.10±0.05)cm，其次為乳糖和可溶性淀粉，但3者間差異不顯著；產孢量以麥芽糖為碳源的處理最佳為(2.42±0.03)× 107個/mL，與以可溶性淀粉為碳源的處理差異不顯著，但2者顯著高于葡萄糖和乳糖的處理。綜合考慮，適合茄病鐮孢藍色變種病原菌的菌絲生長和產孢量增加的碳源為可溶性淀粉。

表3 不同碳氮源對野蠶豆根根腐病原菌絲生長和產孢量的影響

野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍色變種菌對供試的4種氮源利用有一定的差異(表3)。適合病原菌菌絲生長的氮源為硝酸鉀，菌落直徑為(7.13±0.08)cm，其次為硝酸銨和硫酸銨，最差為尿素；而適合產孢的氮源為硫酸銨，產孢量最大為(2.49±0.02)× 107個/mL，顯著高于其他3種氮源。

2.2.3 溫度對根腐病原孢子致死溫度、菌絲生長和產孢量的影響 病原菌在40、45、50 ℃水浴10 min均能萌發，但在55、60 ℃處理10 min后孢子不能萌發，因此在50～55 ℃間將溫度梯度縮小為1 ℃，結果以55 ℃水浴10 min孢子不能萌發，說明該菌的孢子致死溫度為55 ℃、10 min。

由表4可知，在處理的7個溫度條件下，25 ℃處理下野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長最快，菌落直徑最大為(6.72±0.24)cm，顯著高于其他6個處理；同時產孢量也達到最高，顯著高于其他處理。但該菌在低溫條件下，生長速度較慢，在5 ℃時，菌絲不生長和不產孢。野蠶豆根根腐病原菌菌絲生長和產孢適合的溫度范圍25～30 ℃。

表4 不同溫度對根腐病病原菌菌絲生長和產孢量的影響

2.2.4 pH對根腐病病原菌絲生長和產孢量影響 從表5可知，茄病鐮孢藍色變種菌對酸堿度有較強的適應能力。以pH 8時，菌絲生長最好，菌絲直徑最大，為(7.38±0.08)cm，顯著高于其他處理，其次是pH 7的處理。相似的結果也表現于產孢量測定中。因此，pH 7～8是適合茄病鐮孢藍色變種菌菌絲生長和產孢的條件。

表5 不同pH值對野蠶豆根根腐病原菌菌落生長和產孢量的影響

2.2.5 光周期對根腐病病原菌絲生長和產孢量影響 由表6可看出，茄病鐮孢藍色變種菌在3種不同光照條件下，菌落直徑差異不顯著；但對產孢有一定的影響，其中連續光照處理下的產孢量顯著高于其他2種光周期處理。所以連續光照有利于病原菌菌絲生長和產孢。

表6 不同光周期對根腐病原菌菌絲生長和產孢量的影響

2.2.6 不同濕度對根腐病病原菌分生孢子萌發的影響 濕度對野蠶豆根根腐病病原菌茄病鐮孢藍色變種的分生孢子萌發率的影響較大，各處理間的孢子萌發率差異顯著，孢子萌發率與相對濕度呈正相關(圖2)。分生孢子在相對濕度≥50 %時均能萌發，且當濕度為100 %時，分生孢子萌發率最高為(92.33±2.52) %，顯著高于其他處理。

圖2 不同濕度對根腐病病原菌分生孢子萌發的影響Fig.2 Effects of different humidity on conidia germination of Fusarium solani var.coeruleum

2.3 室內藥劑篩選

通過菌絲生長抑制率法測定，發現10種殺菌劑對野蠶豆根根腐病原菌的抑制效果各不相同(表7)。其中尚果乳油和應得懸浮劑的抑制效果較好，其抑菌百分率分別為83.78 %和82.82 %，其EC50低于150 μg/mL，分別為100.94 和126.99 μg/mL；其次為撲海因可濕性粉劑、灰滅可濕性粉劑、甲基托布津可濕性粉劑和靈動水分散粒劑，EC50分別為204.39、231.58、257.79和284.31 μg/mL；效果最差為翠貝，EC50為367.57 μg/mL。

表7 10種藥劑對野蠶豆根根腐病原菌的抑制效果

3 討 論

根腐病是一種危害極大的土傳病害，其病原主要有細菌、真菌和線蟲，其中真菌引起的根腐病占2/3，主要有鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、輪枝孢屬(Verticilliumsp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)、疫霉屬(Phytophthorasp.)、角擔菌(Ceratobasidiumsp．)和球殼孢屬(Macrophominasp.)等真菌，其中由各種鐮刀菌引起的根腐病危害極大[11-14]。根據野蠶豆根的根腐病病原菌采集和病原分離鑒定，確定為茄病鐮孢藍色變種[Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]。通過對野蠶豆根根腐病致病菌菌株YCD-7的生物學特性觀察，適合生長的培養基種類較多，在所測試的3種培養基中，PSA為最佳培養基，相似結果也表現于由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysprum)引起的白術根腐病中[15]。同時該菌生長的溫度范圍較廣，最適溫度為25 ℃；生長pH范圍也廣，最適為pH 7～8；對多種碳源均能利用，菌落生長和產孢的最適碳源為可溶性淀粉；對多種無機氮源也能利用，而菌落擴展的最適氮源是硝酸鉀，產孢最適氮源為硫酸銨；菌絲在連續光照下生長最快，產孢量最高；分生孢子萌發需要在高濕條件下，濕度越高，萌發率越高，其致死溫度為55 ℃、10 min。病原的生物學特性與野蠶豆根根腐病易在屏邊種植基地常年發生有關，且多發于多雨夏季的6-8月。

菌絲生長速率法測定10種殺菌劑對野蠶豆根腐病原菌的室內抑制效果，差異較大，其中尚果乳油(氟硅唑)、應得懸浮劑(腈苯唑)和撲海因可濕性粉劑(異菌脲)的抑制效果較好，其EC50分別為100.94、126.99 和204.39 μg/mL，且前2種藥劑都屬于三唑類殺菌劑，而撲海因屬于二甲酰亞胺類。大量研究發現三唑類農藥對鐮刀菌具有很好的抑制效果，如對葫蘆砧木萎蔫病(Fusariumsolani)具有較好抑制效果的20 %硅唑·咪鮮胺水乳劑；抑制草莓枯萎病(F.oxysporum)的有效藥劑25 %腈菌唑乳油；能明顯抑制馬鈴薯枯萎病(F.oxysporum)的75 %肟菌·戊唑醇乳油[16-18]。甲氧基丙烯酸酯類的吡唑醚菌酯和嘧菌酯、吡啶基乙基苯甲酰胺類的氟吡菌酰胺很少用于該屬病害的防治，這些藥劑常用于灰霉病(Botrytiscinema)、白粉病(Erysiphesp.)和番茄漆斑病(Myrotheciumroridum)的防治中[19-20]。因此在田間藥效防治試驗之前，有必要進行病害病原菌鑒定和室內藥劑篩選準備。

上述結果表明野蠶豆根根腐病原茄病鐮孢藍色變種的適應性強，能夠利用多種碳氮源，生長和存活的溫度及酸堿范圍較廣，喜中性偏堿性環境，高溫高濕條件有利于該病的發生。因此在野蠶豆根種植過程中，可通過改變栽培環境、合理施肥、輪作或化學防治等方法來抑制病原菌的生長與產孢，從而減輕該病的發生。如選擇地勢較高的地塊進行種植，有利于排水；選擇酸性肥料進行施肥，以改善土壤的酸堿環境；也可在雨季來臨之前用防效好的藥劑進行灌根或噴霧等。

4 結 論

通過形態學、病害癥狀觀察和柯赫氏法則，確定野蠶豆根根腐的致病菌是茄病鐮孢藍色變種Fusariumsolanivar.coeruleum，本論文是首次關于野蠶豆根根腐病的報道；同時獲得了影響該菌生長的營養物質種類和環境因素，菌絲生長和產孢的最適合碳源為可溶性淀粉，最適合溫度為25 ℃，最適pH為7～8，濕度對孢子萌發影響較大；室內藥劑篩選出400 g/L氟硅唑、24 %腈苯唑和50 %異菌脲對野蠶豆根根腐病病菌菌絲生長抑制作用最強，可作為防治該病害的化學殺菌劑。