香蕉內生細菌G9R-3分離鑒定及其拮抗香蕉枯萎病菌活性評價

周 維，田丹丹，李朝生，覃柳燕，韋 弟，韋紹龍，劉挺燕，黃素梅

(廣西農業科學院生物技術研究所/香蕉抗病種質創制與病蟲害防控聯合實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】由尖孢鐮刀菌古巴專化型4號小種(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace 4，Foc4)引起的香蕉枯萎病(Fusariumwilt)是目前世界上危害香蕉產業健康發展的最嚴重病害[1]。已有研究表明，選育和種植抗病品種結合生物防治已成為防控香蕉枯萎病最切實可行的策略及方法之一[2-3]。桂蕉9號是廣西首個自主選育的抗枯萎病香蕉新品種[4]，但其抗性等級為中等，重病區種植還存在抗性不足等問題，利用該品種的內生菌資源是開發其配套生物防控菌劑是目前解決該問題的重要途徑。內生菌與宿主存在互利共生關系，產生的活性物質能誘導或增強宿主植物對病蟲害及逆境脅迫的抗性[5-6]。因此，分離鑒定香蕉內生細菌并進行拮抗香蕉枯萎病菌活性評價，對利用香蕉內生菌資源防控香蕉枯萎病具有重要意義。【前人研究進展】張科立[7]、戴英葵等[8]從香蕉植株中分離到具有拮抗Foc4活性的內生勞爾氏菌BEB3及BEB99，二者均能產生鐵載體并能提高香蕉植株的枯萎病防效。田丹丹等[9]、陳博等[10]、王宇光等[11]分別從香蕉植株中分離到的內生解淀粉芽孢桿菌、類芽孢桿菌和陰溝腸桿菌菌株均能促進香蕉植株生長，降低枯萎病對蕉苗的危害。張建春等[12]研究顯示，內生熒光假單孢菌UPMP3和伯克霍爾德菌UPMB3能誘導香蕉感病品種產生Foc4抗性。楊秀娟等[13]研究發現，內生枯草芽孢桿菌EBT1培養液活性物質能顯著提高香蕉組培叢生芽的增殖率并提升植株SOD、PAL、POD和PPO等防御酶活性。桑建偉等[14]研究表明，內生菌回接不同抗性香蕉品種，其定殖量及相對防效存在顯著差異。吳藹民等[15]研究了內生菌73a在不同抗性品種棉花體內的定殖和消長動態。馬鳳娟等[16]研究發現，接種生防菌XP1能提高香蕉根際土壤細菌物種豐富度和有益菌比例,有效防控大田香蕉枯萎病的發生。【本研究切入點】G9R-3菌株的菌體、發酵液及揮發性氣體均對香蕉枯萎病菌(Foc4)有較強抑制作用，但目前關于該菌株抑菌機制及防控枯萎病效果的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】分離鑒定桂蕉9號植株根部內生細菌G9R-3并分析其抑菌機制，回接不同品種香蕉并評價其防效，為開發利用該菌株配套抗病香蕉品種防控枯萎病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株香蕉枯萎病病原菌Foc4、香蕉品種桂蕉1號和桂蕉9號香蕉組培盆栽苗均由廣西農業科學院生物技術研究所提供；紅研2號和萬鐘4號香蕉組培盆栽苗由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。供試培養基參考方中達[17]的方法使用LB和PDA培養基，菌株生理生化試驗所用試劑參考東秀珠和蔡妙英[18]《常見細菌系統鑒定手冊》中的試劑。儀器設備：BIOMETRAT professional PCR儀(德國耶拿)，UVI FireReader 凝膠成像儀(英國UVItec)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生細菌分離、篩選及鑒定 采用三步消毒法[18]分離健康香蕉植株根部內生細菌，利用平板對峙法篩選其中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌活性的菌株。菌株形態學觀察及生理生化特性參考東秀珠和蔡妙英[18]《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法 進行分析。參考陳奕鵬[20]的方法進行分子鑒定及16S rDNA 和gyrB基因序列PCR擴增，然后進行測序并構建系統發育進化樹。

1.2.2 內生細菌平板拮抗Foc4活性評價 配制PDA固體培養基培養病原菌Foc4并制備菌餅，配制NA固體培養基培養內生細菌。將Foc4菌餅(D=5 mm)置于 PDA 培養基中央，在距離其兩側2.5 cm 處用接種環挑取供試內生細菌單菌落進行劃線培養，3 次重復，以不接種拮抗內生細菌的Foc4生長情況為對照，28 ℃恒溫培養7 d后，用游標卡尺測量拮抗帶寬度，計算平板菌落抑制率。菌落抑制率(%)=(對照生長直徑-處理拮抗帶直徑)/(對照生長直徑-菌餅直徑)×100。

1.2.3 內生細菌發酵液對 Foc4菌落生長的影響 按照1.2.2的方法制備Foc4菌餅，LB搖瓶培養制備內生細菌發酵液，0.22 μm濾膜過濾菌體，以發酵液1∶1000接種到未凝固PDA培養基中混勻，待培養基凝固后制備帶毒平板。將Foc4菌餅(D=5 mm)置于帶毒平板中央，3次重復，以未加細菌發酵液的PDA平板為空白對照，28 ℃恒溫培養7 d后，十字交叉法測定Foc4菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-對照菌餅直徑)×100。

1.2.4 內生細菌揮發性氣體對Foc4菌落生長的影響 制備Foc4菌餅備用，采用平板對扣法[20]檢測內生細菌揮發性氣體抑菌作用。在NA培養基平板表面涂布100 μl供試菌株孢子懸浮液，在PDA平板中央接種Foc4菌餅(D=5 mm)。NA平板在下，PDA平板在上，兩平板對扣后用封口膜封閉，3次重復，以空白NA平板為對照，28 ℃恒溫培養7 d后，十字交叉法測定Foc4菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

1.2.5 內生細菌回接不同香蕉品種盆栽苗防效評價 選取生長一致的4個香蕉品種(桂蕉1號、桂蕉9號、紅研2號和萬鐘4號)健康盆栽杯苗，采用常規水肥管理。參照桑建偉等[14]的方法，各取30株香蕉苗用灌根法接種內生細菌發酵液(濃度為1×106CFU/mL，100 mL/株)，每隔10 d接種1次，共接種3次，以不接種內生細菌發酵液的植株為空白對照。最后一次接種內生細菌發酵液10 d后傷根接種107CFU/mL的Foc4孢子懸浮液，60 d后調查植株發病情況。參照農業行業標準(NY/T2248-2012)計算病情指數和進行病害分級。

平均發病率(%)=各處理發病株數/調查總株數×100

病情指數=[∑(各級病株數×該病級)]/(調查總株數×最高病級) ×100

相對防效(%)=(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數×100

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離、篩選和鑒定

從桂蕉9號植株根部分離得到一株內生細菌，通過平板對峙試驗篩選得到具有較強拮抗香蕉枯萎病菌Foc4活性的菌株G9R-3；菌株經革蘭氏染色呈陽性，桿狀，產芽孢，在NA培養基上菌落呈圓形，邊緣不規則，表面光滑濕潤(圖1)，呈淡黃色。其生理生化特性檢測結果見表1。PCR擴增菌株G9R-3的16S rDNA序列全長為1427 bp，在NCBI上進行BLAST比對，結果與B.amyloliquefaciens、B.velezensis和B.subtilis序列相似度均在99 %以上(圖2)。選取相應菌種模式菌株序列構建系統發育進化樹，菌株G9R-3與B.velezensisSQR9、B.amyloliquefaciensFZB42聚在同一分支，親緣關系較近。為進一步確認其親緣關系，采用PCR擴增菌株G9R-3gyrB基因序列與相應菌種模式菌株序列進行BLAST比對，結果(圖3)表明，該菌株基因序列全長為1265 bp，與B.amyloliquefaciensFZB42相似度最高，達99 %，聚于同一分支，親緣關系更近。綜合以上序列比對結果，將菌株G9R-3鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 菌株G9R-3的平板菌落形態Fig.1 Colony morphology of strain G9R-3

表1 菌株G9R-3生理生化特性

圖2 基于16S rDNA序列構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖3 基于gyrB基因序列構建的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on gyrB gene sequence

2.2 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4活性分析

從圖4可看出，以劃線法評價菌株G9R-3拮抗Foc4活性，7 d后檢測抑菌帶寬度為1.34 cm，對照Foc4菌落的直徑為6.84 cm，通過計算得到菌株G9R-3對Foc4菌落的抑制率為83.05 %。說明菌株G9R-3菌體在平板上具有較強的抑制Foc4菌落生長活性。

圖4 菌株G9R-3平板的拮抗Foc4效果Fig.4 Antagonistic effect against Foc4 of strain G9R-3 plate

2.3 菌株G9R-3發酵液的拮抗Foc4活性分析

從圖5可看出，以帶毒平板生長速率法評價菌株G9R-3發酵液拮抗Foc4活性，7 d后測量Foc4菌落在發酵液平板上的直徑為5.33 cm，對照Foc4菌落的直徑為9.24 cm，經計算菌株G9R-3發酵液對Foc4菌絲生長的抑制率為42.35 %。說明菌株G9R-3發酵液中存在抑制Foc4菌絲生長的活性物質。

圖5 菌株G9R-3發酵液對Foc4生長的抑制作用Fig.5 Growth inhibition of Foc4 by fermentation broth G9R-3

2.4 菌株G9R-3揮發性氣體的拮抗Foc4活性分析

平板對扣法評價結果(圖6)表明，菌株G9R-3揮發性氣體處理平板上Foc4菌落的直徑為3.75 cm，對照Foc4菌落的直徑為9.06 cm，經計算揮發性氣體對Foc4菌絲生長的抑制率為58.64 %。說明菌株G9R-3產生的揮發性氣體具有較強的抑制Foc4菌絲生長活性。

圖6 菌株G9R-3揮發性氣體對Foc4生長的抑制作用Fig.6 Growth inhibition of Foc4 by volatile gas G9R-3

2.5 G9R-3回接不同香蕉品種盆栽苗的相對防效

由表2可知，不同香蕉品種先接種G9R-3、再接種Foc4后，香蕉枯萎病發病率及病情指數均顯著降低(P<0.05)，表明G9R-3能有效提升各香蕉品種對枯萎病的抗病性；各香蕉品種的相對防效排序為桂蕉1號>桂蕉9號>紅研2號>萬鐘4號，其中接種菌株G9R-3后感病品種桂蕉1號的發病率由對照的90.00 %降至36.67 %，病情指數由87.94降至30.78，相對防效達65.00 %；抗病品種中，G9R-3接種紅研2號的相對防效為29.91 %，接種萬鐘4號的相對防效為16.11 %，而接種桂蕉9號的效果最佳，發病率由33.33 %降至13.33 %，病情指數由23.57降至12.06，相對防效達48.83 %。

表2 內生細菌G9R-3回接不同香蕉品種盆栽苗的抗病性表現

3 討 論

內生菌具有在宿主體內定殖的特性，能有效發揮其與宿主互利共生的作用，分離、利用香蕉內生菌防控枯萎病是目前香蕉枯萎病研究的熱點之一[21-22]。

內生菌的主要生防機制包括生態位競爭、活性物質拮抗和誘導植物免疫反應等[23-24]。柴慶凱等[25]研究發現，解淀粉芽孢桿菌LJ02能誘導黃瓜產生β-1,3葡聚糖酶和幾丁質酶破壞病菌細胞壁，還能通過POD誘導植株產生木質素和酚類物質抵抗病害侵染，提高黃瓜對灰霉病菌的抗性。Deleu等[26]研究認為內生芽孢桿菌產生的表面活性素雖無直接抗真菌活性但能增強伊枯草菌素的抗真菌能力，能在植物根部表面形成生物膜，阻止病原菌入侵。劉端木等[27]從赤豆(Vignaangularis)中分離得到抑制赭曲霉和黃曲霉生長的拮抗細菌 SC-B15，能產生抑菌蛋白。在香蕉枯萎病防控方面，朱森林等[28]、田丹丹等[9]利用香蕉內生解淀粉芽孢桿菌BEB33、GKT04回接香蕉，獲得良好的生防效果。桑建偉等[14]報道，香蕉內生解淀粉芽孢桿菌BEB17在不同抗性品種上的定殖量及防效存在差異，內生菌更容易在感病品種上定殖，產生的脂肽類物質能抑制枯萎病菌生長。周維等[29]研究發現，G9R-3發酵液產生的脂肽類化合物能破壞Foc4 細胞膜并引起菌絲腫大和畸形，并抑制其孢子萌發。本研究從抗病品種桂蕉9號植株根部分離得到一株內生解淀粉芽孢桿菌(菌株G9R-3)，通過接種不同抗枯萎病香蕉品種(抗性表現為桂蕉9號>萬鐘4號>紅研2號>桂蕉1號)，發現其能提高盆栽抗、感病香蕉品種的防治效果，其中與桂蕉1號和桂蕉9號的親和性更高，接種防效更佳，可能與菌株G9R-3在桂蕉1號和桂蕉9號中的定殖量較大有關。

內生菌在植株體內的有效定殖是提高枯萎病防效的關鍵[30]。吳藹民等[15]報道內生菌更易于在感病品種中定殖，本研究還需進一步探明菌株G9R-3在香蕉植株上的定殖規律。此外，本研究的菌株G9R-3分離自桂蕉9號，回接防效試驗結果較優，因此，抗病香蕉品種的抗病性與菌株G9R-3種群的相關性也需要進一步探究。

4 結 論

從抗病品種桂蕉9號健康香蕉植株根部分離得到的一株內生細菌G9R-3，鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其菌體、發酵液及揮發性物質均具有拮抗香蕉枯萎病菌Foc4的活性，能提高盆栽抗、感病香蕉品種的防治效果。