SYNM在大腸癌中的表達及意義

孫伯堯，于鎧銘，鄭 巖，孫志霞，岳新顏，姜 洋*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.長春中醫藥大學)

大腸癌(CRC)是全球第三大最常見的惡性腫瘤，全世界第二大癌癥死因，研究顯示，在我國大腸癌的發病人數呈穩步增長趨勢，且死亡率逐年增加[1]。因此，研究探索大腸癌發生、發展過程對疾病的診治十分重要。聯絲蛋白(SYNM)是一種中間絲(IF)蛋白質，IF家族蛋白在決定細胞形狀及功能、維持細胞骨架及調節細胞運動方面均發揮重要作用。與IF家族其他蛋白相比，SYNM蛋白的C末端結構域較長，具有結合紐蛋白、α-肌動蛋白等參與細胞運動，粘附和收縮功能蛋白的靶位點，是細胞黏附和轉移必不可少的成分[2,3]。本文應用二維色譜-質譜聯用技術和免疫印跡技術檢測大腸癌及配對癌旁組織中SYNM蛋白的表達情況，旨在研究SYNM與大腸癌發生、發展的聯系。

1 材料與方法

1.1 標本收集

本實驗標本來自吉林大學中日聯誼醫院結直腸外科手術中切除的20例大腸癌及癌旁組織，經病理學證實均為DukesB期腺癌。所有患者術前均未接受過激素、放化療治療，且均經患者同意。標本離體后，立即用生理鹽水沖洗干凈，液氮速凍，放-80℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

美國西格瑪公司生產的碳酸氫氨、尿素、DNA 酶及 RNA 酶，美國Bio-Rad公司生產的蛋白質定量試劑盒、2-碘乙酰胺(IAM)，DTT、TPCK修飾的測序級胰酶購買于美國Promega公司，1200納升級液相色譜、LTQXL離子肼質譜儀均購買于美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1組織總蛋白的提取及濃度測定 取出-80℃保存的組織標本，快速充分研磨，形成粉末狀，加入裂解緩沖液，比例為每50 mg組織加入100 μl裂解緩沖液，為去除樣本中的DNA、RNA向裂解好的樣本中加入DNA酶和RNA酶，低溫離心，所得上清液即為總蛋白。考馬斯亮藍染色，使用核酸蛋白分析儀在595 nm處測得吸光度，采用標準曲線法計算出組織總蛋白濃度。

1.3.2樣品多肽混合物的制備 向提取出的總蛋白中加入25 mmol/L NH4HCO3，稀釋總蛋白，降低尿素濃度。

再加入二硫蘇糖1 mol，將樣品終濃度調整為20 mmol/L，56℃避光還原1小時。待反應物降至室溫后，加入1 mol/L的2-碘乙酰胺(IAM)混勻使其終濃度為50 mmol/L，室溫避光反應半小時。向其中加入TPCK修飾的測序級胰酶，比例為混合物：胰酶=50∶1，37℃酶切過夜，第二天真空抽干，分裝后置于-80℃保存。

1.3.3二維色譜-質譜聯用技術分離鑒定多肽混合物 用0.1%甲酸(Buffer A)溶解多肽混合物，每50 μg樣品色譜上樣，流速2 μl/min，時間3小時，反向色譜洗脫后用LTQXL離子肼質譜儀分析，質核比范圍設定為400-2000 amu，再采用數據依賴的方式進行二級掃描。

1.3.4免疫印跡 提取組織總蛋白并測定濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本，再將分離的組分轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，敷一抗4度搖床過夜，第二天洗滌后加二抗反應，顯影壓片。

1.4 統計學分析使用SPSS11.0軟件，依據SEQUEST法，對液質聯用圖譜進行t檢驗，當P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 二維色譜-質譜聯用技術對樣本酶解混合物的分析結果

根據大腸癌組織及癌旁組織蛋白質的豐度變化進行判斷，判定標準為：兩組樣品中譜圖數的比值≥1，兩組樣品中譜圖數的差值≥72，得出目標蛋白SYNM在大腸癌組織中表達水平明顯下調，SYNM質譜結果見圖1。

圖1 SYNM質譜圖

2.2 Western blot驗證SYNM蛋白的表達情況

免疫印跡實驗結果顯示SYNM蛋白在大腸癌組織中低表達，而在配對的癌旁組織中高表達，此結果驗證了二維色譜-質譜聯用技術實驗結果的準確性，結果見圖2。

圖2 大腸癌中SYNM免疫印跡圖

3 討論

大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生發展是一個多基因參與、多步驟協同的漸進性過程，明確其相關基因的表達及作用，篩選出有意義的生物學標志性蛋白是當前研究熱點。蛋白質組學(proteomics)技術可用于檢測癌及癌旁組織中的差異蛋白，為鑒定與癌癥發生發展密切相關的蛋白質提供重要的技術支持。

SYNM是IV型IF蛋白，人類synemin基因位于15q26.3號染色體上，通過選擇性剪接生成兩種亞型(α，β)，廣泛表達于大多數哺乳動物收縮型細胞(心臟，骨骼肌等)及某些非收縮性細胞(神經膠質細胞、晶狀體等)[4]。由于Synemin頭部結構域較短，其無法自我聚合組裝成細絲，但可與Ⅲ型波形蛋白、結蛋白共聚發揮作用[5]。有研究表明，SYNM蛋白參與調節細胞的粘附及運動，其機制與LIM域蛋白zyxin相互作用有關[6]。同時，SYNM蛋白也是一種A激酶錨定蛋白(AKAP)，通過調節蛋白激酶A在Z盤和肌膜上的蛋白磷酸化影響肌肉的修復和生長[7]。目前，很多學者對SYNM蛋白在腫瘤發生發展中的作用進行研究。E.Noetzel指出，SYNM蛋白在乳腺癌中下調表達，機制與SYNM啟動子甲基化有關，且啟動子甲基化狀態可用于預測乳腺癌患者復發的風險[6]。Sun N研究發現，當用RNA干擾，誘導SYNM表達缺失時，會導致宮頸癌HeLa細胞粘附減少[8]。還有人指出，SYNM是miR-376c(一種抑癌性miRNA)的靶基因，miR-376c下調引起SYNM的異常表達可能是宮頸癌轉移的主要原因[9]。A.Pitre研究顯示，SYNM蛋白通過隔離PP2A(蛋白磷酸酶2A)促進Akt活化，進而對膠質母細胞瘤細胞的增殖產生正向調節作用[10]。與正常肝臟相比，人肝細胞癌中SYNM蛋白下調表達[11],Schmitt-Graeff A等人還指出，在炎性疾病的門靜脈周圍成纖維細胞和肝內膽管癌的上皮細胞中SYNM蛋白上調表達，因此，可以通過SYNM的表達水平區分不同形式的纖維化和肝癌[12]。還有研究顯示，SYNM可能與卵巢癌的發病機制有關，是鉑治療卵巢癌獨立的預后基因[13]。最新研究表明，SYNM可作為胃腸道間質細胞瘤的診斷標準，其與CD117的差異表達有助于區分Cajal的間質細胞和肥大細胞[14]。

本研究通過二維色譜-質譜聯用技術證實SYNM在大腸癌組織中表達明顯低于配對的癌旁組織，并運用免疫印跡實驗驗證了結果的準確性。但對于SYNM蛋白在大腸癌發生、發展中的作用機制尚未完全明確，是進一步深入研究的方向。