長鏈非編碼RNA XIST海綿miR-34通過Wnt/β-catenin信號通路促進結腸癌進展的機制

洪 森,李世權,劉 濤,康振華

(吉林大學第一醫院 結直腸肛門外科,吉林 長春130021)

結腸癌是癌細胞在結腸組織中形成的最常見的惡性腫瘤之一。作為世界第三大最常見的癌癥和第二大癌癥相關死亡原因[1]，結腸癌的發病率和死亡率在中國逐漸增加，2015年新增病例376,300例，死亡191,000例[2]。目前，結腸癌患者的標準治療方法包括手術、放療和化療或聯合治療[3]。盡管在治療技術方面取得了巨大進步，但由于復發和轉移，結腸癌的5年生存率仍然低于40%[4]。闡明結腸癌的侵襲機制，探索結腸癌治療的潛在新靶點勢在必行。作為一類非編碼RNAs，長非編碼RNAs(lncRNAs)被定義為長度大于200個核苷酸，在多種細胞過程中發揮重要作用，如調節基因表達、翻譯后加工和腫瘤發生[5]。LncRNAs X-inactive 特異性轉錄體(XIST)，來自XIST基因，是哺乳動物X染色體轉錄沉默的主要調控者[6]。先前的研究已經證實XIST在多種癌癥中起到了腫瘤調節劑的作用，如膠質母細胞瘤[7]、乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、肝細胞性肝癌[10]。盡管如此，XIST 在結腸癌中的作用仍然不清楚。

MicroRNAs是一種短的內源性非編碼分子(大約19-23個核苷酸長度)，通過與靶基因的3’-未翻譯的區域(3’-UTRs)結合來調節基因表達，在維持穩態方面起著重要作用[11]。目前，人們普遍認為 miRNAs在腫瘤發育過程中可能充當癌基因或抑制基因[12]。對miR-34a 的功能性研究已經證明它可以抑制結腸癌的增殖和轉移[13]。競爭性內源性RNA(ceRNA)假說證明，lncRNAs作為miRNA海綿來調節miRNA靶基因的表達，從而參與癌癥的進展。然而，XIST能否與 miR-34a 相互作用調節結腸癌的發生發展還有待于進一步闡明。

因此，本研究的目的是調查XIST在結腸癌進展中的表達水平，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究的對象為人類結腸癌組織和相應的非腫瘤組織。

1.2 實驗方法

1.2.1病人和組織樣本 所有患者均獲得知情同意，本研究經吉林大學第一醫院醫學倫理委員會批準。在2017年3月至2019年2月期間進行初次手術切除的患者中，獲得了人類結腸癌組織和相應的非腫瘤組織(n=120)。手術后，標本立即冷凍在-80℃以備進一步使用。參與研究的患者的特征見表1。

表1 結腸癌患者XIST表達與臨床參數的相關性

1.2.2細胞培養和轉染 人結腸癌細胞系(SW480,Lovo,HCT116 與 HT29)和正常結腸上皮細胞系NCM460均購自中國科學院細胞庫(上海，中國)。所有細胞均在含有10% 胎牛血清((FBS公司，美國)和1% 青霉素/鏈霉素的Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium 中(DMEM,Gibco,USA))培養基，在濕潤、含5% CO2的37℃培養箱中培養。將SW480和HCT116細胞接種于平板，按照生產廠家的規定，使用 Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，MA，USA)轉染 si-XIST，miR-34a 抑制劑或其陰性對照(NCs)。

1.2.3細胞活力測定 細胞(3×103)培養于96孔板中，培養24 h，用0.5 mg/mLMTT染色24 h。去除上清液，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解沉淀。用酶聯免疫吸附測定儀在490 nm 處測定每個孔的光密度(OD值)。

1.2.4菌落形成試驗 在集落形成實驗中，將細胞種植到密度為5×103的6孔板中。然后，細胞在37℃培養，加入5%CO2，培養2周。最后用4% 多聚甲醛固定菌落，用0.1% 結晶紫染色30 min。然后，用光學顯微鏡計算菌落數。

1.2.5細胞遷移試驗 將密度為1×105的細胞分別接種于含1% FBS的培養基上腔。下腔室用10% FBS培養基充填。培養24 h后，上表面粘附的細胞被去除，遷移至下室的細胞用0.1% 結晶紫染色。

1.2.6實時定量PCR分析 根據制造商的說明書，用trizol 試劑(中國上海)從細胞中提取總RNA。利用反轉錄試劑盒(takara biotechnology，中國大連)合成了互補DNA(cDNA)。用定量PCR方法測定cDNA的相對數量，用2-ΔΔCt方法計算GAPDH基因的相對表達水平。

1.2.7熒光素酶報告分析 將含 miR-34a結合位點的XIST和WNT1的3’-UTR分別擴增并克隆到pGL3-基本熒光素酶載體(Promega，美國)中。細胞接種于培養皿中，并根據制造商的規定，將相關的寡核苷酸(XIST和WNT1野生型或突變型報告載體miR-34a 模擬或陰性對照)與脂質體2000試劑混合，用雙熒光素酶報告系統(Promega,Madison，美國)轉染24 h后檢測熒光素酶活性。用Renilla 熒光素酶作為內參照物。

1.2.8Western blotting分析 培養細胞用冰冷的PBS洗滌，在添加蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖器中溶解。蛋白樣品經電泳后，與從Abcam Campany購買的一抗(anti-WNT1,anti-β-catenin,anti-MMP7,anti-cyclinD1,anti-cMyc,1∶1000稀釋)孵育。樣品與辣根過氧化物酶結合的次級抗體孵育。用Imagej 軟件量化。

1.2.9動物實驗 5周齡雄性BALB/C裸鼠(體重18±2 g)，日/夜循環22-24℃，日/夜循環12 h。皮下異種移植實驗方法:將感染 si-NC或 si-XIST的SW480細胞(5×105)皮下注射于小鼠右側(n=6只/組)。每5天檢查一次腫瘤體積，計算公式為:體積=0.5×長×寬×高。注射后25天，安樂死處死動物，測量腫瘤重量。動物實驗獲得吉大一院動物倫理委員會批準。

1.3 數據處理

2 結果

2.1 XIST 在結腸癌組織中表達上調，與預后不良有關

為了研究XIST在結腸癌進展中的作用，我們使用qRT-PCR檢測了XIST在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達顯示XIST在結腸癌組織中的表達高于癌旁組織(圖1A)。圖1B顯示每例患者XIST表達水平(結腸癌組織標本)的倍數變化。我們將120名患者分為高表達組(n=68)和低表達組(n=52)(表1)。結果顯示XIST上調與晚期TNM分期、淋巴管及遠處轉移呈正相關(圖1C、表1)。但XIST升高與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關性(表1)。Kaplan-Meier 總生存率曲線和對數秩檢驗表明，XIST水平高的患者總生存率低于XIST水平低的患者(圖1D)?？傊?，XIST在結腸組織中表達上調，與預后不良相關，提示XIST在結腸癌中的致癌作用。

圖1 結腸癌組織中 xist 表達上調，與預后不良相關

2.2 XIST 基因敲除對結腸癌細胞增殖和侵襲的抑制作用

我們發現4株結腸癌細胞系的XIST表達水平與正常細胞系相比上調(表2)。為了驗證XIST基因在結腸癌發生發展中的作用，通過siRNA轉染SW480和HCT116細胞，建立了穩定的XIST基因沉默體系(表3)。MTT測定XIST基因沉默對兩種細胞株的增殖均有抑制作用(表4)。集落形成實驗表明，XIST沉積可以誘導兩個細胞系形成集落少于對照細胞。轉錄抑制實驗表明，XIST沉默抑制了細胞的入侵能力。

表2 不同細胞系中XIST相對表達量

表3 體外轉染SW480和HCT116細胞系的siRNA建立了XIST沉默表達結果

表4 在兩個細胞系中si-XIST轉染細胞的生長速度

2.3 XIST作為miR-34的分子海綿

越來越多的證據表明，lncRNA可以像海綿一樣與特定的miRNA結合。利用生物信息學分析方法預測了小分子與XIST結合的候選靶點發現XIST的3’UTR與miR-34a 結合的程度非常保守。與鄰近正常組織樣本相比，結腸癌組織中miR-34a水平降低。與正常細胞相比，4株結腸癌細胞株miR-34a的表達水平降低。熒光素轉運體實驗證實了在 miR-34模擬物和XIST野生型中熒光強度降低的結合。熒光素酶報告分析證實了miR-34a抑制劑和XIST野生型的熒光增強結合。此外，si-XIST 轉染細胞后，miR-34a表達上調，而 miR-34a抑制劑可逆轉這一過程。MTT實驗表明，miR-34a抑制劑能夠緩解si-XIST對細胞增殖的抑制作用。細胞集落形成實驗和transwell實驗表明，miR-34a抑制劑能夠緩解si-XIST對兩個細胞集落數和遷移數的抑制作用。

2.4 miR-34a 直接以WNT1的3’-UTR為目標

我們使用生物信息學分析檢測了miR-34a的計算預測目標。結果顯示WNT1的3’端高度保守，與miR-34a 結合。WNT1水平在結腸癌組織中高于相鄰正常組織。WNT1表達水平在4株結腸癌細胞系中高于正常細胞系。熒光素酶報告基因測定表明，轉染miR-34a可抑制細胞的相對熒光素酶活性，提示miR-34a 對 WNT1表達與WNT1的3’-UTR相互作用具有抑制作用。如圖2，表5所示，在 mRNA和蛋白水平上，在SW480細胞中miR-34a水平的過度表達下調WNT1表達。總的來說，miR-34a通過與3’-UTR結合，抑制WNT1的表達。

表5 WNT1灰度值測定結果

圖2 WNT1 mRNA及蛋白表達結果

2.5 XIST沉默抑制Wnt/β-catenin 信號通路

轉染組與對照組相比，48 h WNT1和β-catenin 表達有統計學差異，si-XIST抑制WNT1和β-catenin的表達，miR-34a抑制劑可逆轉WNT1和β-catenin的表達。c-Myc、cyclinD1和MMP-7的表達在PCR和western blot檢測中有統計學差異，它們是β-catenin 的靶基因。si-XIST能抑制c-Myc、cyclinD1和MMP-7的表達，這些表達都是由miR-34a抑制劑調節的。

2.6 XIST基因敲除抑制結腸癌生長的實驗研究

為了進一步確定XIST在體內是否影響腫瘤發生，我們將si-NC或si-XIST轉染的SW480細胞注射到裸鼠體內。與si-NC組相比，si-XIST組顯示腫瘤體積、腫瘤大小和重量減少(腫瘤體積變化如表6所示)，表明XIST抑制腫瘤在體內的生長，提示XIST過表達促進了結腸癌的進展。

表6 腫瘤體積變化(mm3)

3 討論

結腸癌是東西方國家最常見的癌癥，每年影響超過一百萬人[14]。雖然近年來癌癥診斷和治療的進展改善了臨床結果，但結腸癌患者的預后仍然令人沮喪。許多非編碼RNAs(ncRNAs)與結腸癌的發生密切相關[15]。作為ncRNAs的一個重要成員，lncRNAs已被報道在結腸癌的發展和進展中發揮了關鍵作用[16]。Lncrnaxist 是重要的沉默一個X染色體在女性的發展[17]。許多研究表明XIST基因的異常表達會導致人類癌癥[18]。然而，XIST在結腸癌中的作用和機制尚不清楚。本研究發現，XIST在結腸癌組織中的表達高于癌旁組織，且XIST上調與晚期TNM分期、淋巴管及遠處轉移呈正相關。但XIST升高與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關性。Kaplan-Meier 總生存率曲線和對數秩檢驗表明，XIST水平高的患者總生存率低于XIST水平低的患者?？傊?，XIST在結腸組織中表達上調，與預后不良相關，提示XIST在結腸癌中的致癌作用。

LncRNAs對常見的miRNAs起著海綿的作用，并消除了這些miRNAs對其靶向轉錄本的內源性抑制作用[19]。利用生物信息學預測程序，我們發現XIST基因3’UTR與miR-34a結合高度保守。si-XIST轉染細胞后，miR-34a表達上調。而miR-34a 抑制劑可以緩解si-XIST對結腸癌細胞增殖的抑制作用，這些數據表明，它可以通過靶向miR-34a來調節結腸癌細胞的增殖。

WNT/β-catenin信號途徑的異常表達可能與結腸癌的發病有關[20]。作為信號通路的中樞效應器，β-catenin向細胞核的轉位導致生長和侵襲相關基因的表達，如 cyclinD1和 c-Myc[21]。生物信息學分析表明miR-34a與WNT1的3’-UTR密切相關。此外，miR-34a的過度表達可降低WNT1 mRNA及相關蛋白的表達。si-XIST抑制了WNT1和β-catenin 的表達，miR-34a抑制劑逆轉了這兩種表達。c-Myc、cyclinD1和 MMP-7的表達在PCR和western blot檢測中存在統計學差異，它們是β-catenin的靶基因。si-XIST對miR-34a抑制劑挽救的c-Myc、cyclinD1和MMP-7表達有抑制作用，這表明XIST通過激活WNT/β-catenin 信號通路調節結腸癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述：XIST通過WNT/β-catenin信號通路在miR-34a 靶向的結腸癌進展中起重要作用，為結腸癌的發病機制和潛在治療靶點提供了新的認識。