艱難梭菌耐藥性及其機制研究進展

劉霽萱，李詠梅

(北華大學基礎醫學院，吉林 吉林132013)

艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭陽性厭氧菌，廣泛存在于自然環境中，常見于動物和人體腸道中，艱難梭菌屬于人體腸道的正常菌群。艱難梭菌感染(CDI)是由產毒株艱難梭菌過度繁殖導致腸道菌群失調并釋放毒素引起的，被認為是干擾糞便微生物群的直接結果，導致艱難梭菌和毒素表達的過度生長。這與抗生素的使用密切相關。但是，其他幾種危險因素也與CDI的發展有關，包括胃酸抑制，高齡，醫院暴露以及細胞或體液免疫功能低下[1]。主要臨床癥狀為發熱、腹痛、水樣便腹瀉[2]。

自2002年起發達國家如歐洲、美國等地區多次爆發艱難梭菌感染，患者發病率和死亡率迅速增加。近年來，由于廣譜抗生素的大量使用，艱難梭菌的抗藥性也逐漸增加，這不僅加重了患者的痛苦，同時也加重患者的經濟負擔[3]。本文就近年來艱難梭菌耐藥性及耐藥機制進行詳細闡述。

1 艱難梭菌致病機制

1.1 毒力因子

艱難梭菌致病的毒力因子分為毒素性和非毒素性。其中具有毒素性的毒力因子分別為TcdA、TcdB和CDT。TcdA、TcdB均為葡糖基轉移酶，可以滅活宿主細胞的GTP酶，破壞細胞骨架，導致細胞的凋亡[4]。除TcdA和TcdB外，一些艱難梭菌分離株，特別是027和078核糖型菌株，還產生二元毒素，也稱為艱難梭菌轉移酶(CDT),二元毒素可對宿主細胞肌動蛋白進行修飾進而破壞細胞骨架。瑞典的一項回顧性研究得出的結論是，與不分核糖型并且不產生CDT的菌株感染相比，感染CDT的艱難梭菌菌株的人死亡率更高。非毒素性的毒力因子在其致病機制中也發揮著重要作用，目前對其研究涉及到艱難梭菌黏附、定植、免疫逃避、孢子產生有關的一些毒力因子，如纖維素結合蛋白等[5]。它的研究對認清艱難梭菌的致病機制及有關疫苗的研發具有潛在價值。

1.2 毒力相關基因

艱難梭菌毒力菌株的基因組均有一個19.6kb的致病決定區(pathogenicitylocus，PaLoc)，TcdA和TcdB基因均位于致病區域內。除了TcdA和TcdB,PaLoc還編碼了另外3個名為TcdR、TcdE和TcdC的基因。TcdA和TcdB在TcdR、TcdC以及TcdE等基因調控下分泌TcdA和TcdB蛋白。TcdA、TcdB以及 TcdR在細菌靜止期轉錄，而TcdC轉錄發生于對數生長期，TcdR可能對TcdA、TcdB表達發揮促進作用，而TcdC可能發揮抑制作用[6,7]。目前關于tcdE的調控作用尚存在爭議，李先平等[8]的研究表明，tcdE與tcdA和tcdB的轉錄呈正相關，提示tcdE對tcdA、tcdB發揮正調控功能。

2 艱難梭菌對常見抗菌藥物的耐藥機制

2.1 甲硝唑

甲硝唑是一種硝基芳香藥物，它是治療輕度至中度艱難梭菌感染的首選抗菌藥物，大多數臨床艱難梭狀芽孢桿菌分離株在體外仍對甲硝唑高度敏感。2008年研究發現有12%的臨床分離株對甲硝唑表現出異質耐藥性并且是可誘導的，而不是由于nim基因的存在[9]。2015年一項研究報告了在以色列傳播的對甲硝唑敏感性較低的菌株RT027，它們在以色列造成嚴重感染，并于2013年在耶路撒冷廣泛暴發[10]。這種耐藥性是一個多因素過程，涉及不同代謝途徑的改變。此外，最近在體外獲得的證據似乎表明亞抑制濃度的甲硝唑能夠增強RT010菌株的生物膜產量，該菌株對這種抗生素敏感或易感性降低，表明生物膜可能在艱難梭菌對甲硝唑的耐藥性中發揮作用[11]。盡管對甲硝唑敏感性降低的機制未完全了解，但我認為，研究甲硝唑敏感性降低對復發性CDI的病理生理學有潛在的影響。

2.2 萬古霉素

萬古霉素，是用于中度至重度CDI的一線抗生素,由糖基化的六肽鏈和芳基醚鍵交聯的芳香環組成，在胃腸道中吸收較差。肽聚糖是細菌細胞壁的重要組成部分，其作用機制可抑制肽聚糖的生物合成。在腸球菌和葡萄球菌中經常觀察到對萬古霉素的耐藥性，但在艱難梭菌中則沒有如此廣泛的傳播，耐藥機制仍不清楚。但在艱難梭菌中發現了幾種類似于Tn 1549的元素[12]，與糞腸球菌中描述的原始Tn 1549元素不同，艱難梭菌的Tn 1549樣元素不具有功能性van B操縱子。Ammam F等[13]發現在許多艱難梭菌分離物中發現了一個與糞腸球菌中發現的類似van g的基因簇，盡管該簇基因表達了，但它不能促進對VAN的抗性。已經發現生物膜中的艱難梭菌對高濃度的VAN(20 mg/l)具有更高的抵抗力，并且似乎在存在亞抑制濃度和抑制濃度的抗生素的情況下誘導了生物膜的形成[14]。

2.3 利福霉素和非達索霉素

利福霉素(Rifamycin,RIF)，特別是利福昔明(RFX)，最近已被視為治療復發性CDI的“追趕者療法”。非達索霉素(FDX)是一種新型殺菌的窄譜大環抗生素，用于治療具有高復發風險的CDI。RIF和FDX都是細菌轉錄的抑制劑，但它們具有不同的RNA聚合酶(RNAP)靶位點。FDX與RNAP的“開關區域”結合，RNAP是與RIF靶標相鄰但不重疊的靶標位點[15]。艱難梭菌中的利福霉素類易感性可以通過測試對RIF(一種與RFX相關的利福霉素)的易感性來評估。最近的研究數據表明，11%的艱難梭菌臨床分離株對RIF有耐藥性，總體耐藥率似乎正在上升[16]。

2.4 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類藥物屬于廣譜抗生素，與CDI密切相關。菌株027的普遍流行可能與對氟喹諾酮類藥物的耐藥性有關。在美國和德國，莫西沙星的耐藥率約為36%和68%，加拿大莫西沙星的耐藥率可高達83%。最近的研究發現，在巴西和以色列，莫西沙星的耐藥率分別為8%和4.76%。新西蘭，瑞典，中國和法國，對艱難梭菌的氟喹諾酮耐藥率在7%至40%之間[17]。細菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制主要分為：(1)編碼基因突變導致藥物靶點改變，導致對藥物的親和力降低(2)藥物的主動流出增加或通透性降低。Oh H.,Edlund C.[18]研究表明，艱難梭菌對喹諾酮的耐藥性是由于DNA促旋酶亞基GyrA和(或)GyrB的變化所致,這些突變可以在喹諾酮耐藥性決定區域(QRDR)中發現,T82I是GyrA中最常見的突變位點。D71V，T82V，D81N，A83V，A118V和A118T是GyrB中最常見的突變位點。

2.5 紅霉素和克林霉素

對于這一類藥物目前各國報道的耐藥率均較高，Tickler I.A.等[19]研究報告稱，美國30多家醫院發現艱難梭菌對克林霉素的耐藥率在36%左右。西班牙、波蘭和新西蘭對克林霉素的耐藥率約為74%、65%和61%。在中國、日本、韓國和伊朗克林霉素的耐藥率約為73.5%、87.7%、81%和89.3%[17]。這類藥物作用于細菌核糖體50S亞基，并通過抑制肽鏈的延伸，從而對細菌蛋白質的合成進行干擾。臨床病原體主要通過核糖體靶標變化或主動外排而對紅霉素和克林霉素具有耐藥性，而酶的失活也可導致細菌產生耐藥性。而且erm基因陰性的艱難梭菌還可以表現出高水平的紅霉素耐藥性，但是機制尚不清楚[20]。

2.6 四環素

四環素(TET)是一種快速抑菌劑，耐藥性在各國之間有所不同，從2.4%到41.67%[21]，四環素可與細菌核糖體30S亞基的軸突起始部分特異性結合，從而防止氨酰基-tRNA與核糖體結合，抑制肽鏈延長和蛋白質合成。四環素的耐藥機制主要與四環素抗性蛋白(tetM)和主動外排系統(tet A，B，C，D等)有關[22]。艱難梭菌主要通過核糖體保護蛋白(tetM)從而對四環素耐藥。

3 結語

艱難梭菌的耐藥性在世界范圍內迅速增長，近年來艱難梭菌感染已成為全球性問題。由于對治療藥物的耐藥性逐漸增加，使用這些抗生素的局限性引起了極大的關注，同時需要進一步研究以了解艱難梭菌的耐藥機制，這將為預防以及治療CDI提供新的目標和新的思路。此外，在臨床上需要更多地關注艱難梭菌的耐藥性，以免盲目使用廣譜抗菌藥物，需盡量減少艱難梭菌感染的傳播和發生次數。