利用纖維床生物反應器發酵生產鏈霉素

賈嘯靜，楊尚天

(1.華北制藥華勝有限公司 河北省工業企業試驗研究中心，河北 石家莊 052160；2.美國俄亥俄州立大學化學與生物分子工程系，俄亥俄 43221)

鏈霉素(Streptomycin)是一種常見的氨基糖苷類抗生素[1]，由灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)發酵產生。鏈霉素曾經是抗結核治療的首選藥物[2]，由于耳毒性副作用[3]，其應用大大受限。近年來隨著農業的現代化發展，鏈霉素在農業、畜牧業和水產業方面的需求逐漸增加。目前，鏈霉素的通用生產方法為液體深層攪拌發酵，該方法會產生較大的菌體量，給后期處理帶來一定的困難，加上廢棄菌體處理、廢水排放等環保成本的增加對鏈霉素生產企業造成了很大的壓力，迫切需要尋找高效的鏈霉素生產方法。

纖維床生物反應器(fibrous-bed bioreactor，FBB)是由美國俄亥俄州立大學楊尚天教授在傳統填充床反應器(packed-bed reactor，PBR)基礎上改進并發明的一種新型生物反應器。該反應器選用棉質纖維作為固定化載體，具有無毒無害、孔隙率高(>95%)、比表面積大(>40 m2·m-3)、細胞載量高、不影響細胞正常的生長代謝等優點，廣泛應用于丙酸、丁酸等有機酸發酵以及動物細胞高密度培養等領域[4-5]。近年來隨著生物發酵技術的不斷發展，FBB的應用范圍逐漸擴大。Xu等[6]成功將短密青霉固定在旋轉FBB上發酵生產霉酚酸，并達到了14 d 5.7 g·L-1的水平。

基于此，作者將FBB應用于鏈霉素發酵生產，利用纖維床反應器固定灰色鏈霉菌，對發酵培養基氮源進行優化，并與傳統攪拌發酵進行比較，以期建立一套適用于鏈霉素固定化發酵生產的方法。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

StreptomycesgriseusB-IC91，由美國農業研究菌種保藏中心(NRRL)提供。

平面培養基(g·L-1)：可溶性淀粉10，K2HPO41，MgSO4·7H2O 1，NaCl 1，(NH4)2SO42，CaCO32，微量元素(1 L中FeSO4·7H2O 1 g，MnCl2·4H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 1 g)0.1 mL，瓊脂15，pH值 7.2～7.4；培養7～9 d。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖10，黃豆粉3，KH2PO40.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，CaCO35，pH值 7.0；28 ℃培養48 h。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖40，黃豆粉30，淀粉10，(NH4)2SO46，NaCl 2，MgSO4·7H2O 1，CaCO35，pH值7.0；28 ℃培養7 d。

1.2 發酵裝置

FBB由一個1 L的玻璃攪拌式發酵罐和一根直徑80 mm、高300 mm的雙層玻璃柱纖維床反應器組成。纖維床反應器內由一條18 cm×18 cm的100%棉質毛巾與一張約25 cm×25 cm的交聯鋼絲網組成，二者疊放并卷成圓筒狀，置于玻璃柱內。纖維床反應器通過上下2根乳膠管與發酵罐連通，發酵液通過蠕動泵泵入纖維床反應器內，與纖維床充分接觸吸附后，發酵液從上端乳膠管回流至發酵罐內，完成物料的交換和循環。

1.3 鏈霉素的分析方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精確稱取鏈霉素標準品，用純水稀釋配制成10 000 U·mL-1的標準儲備液。準確吸取標準儲備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，稀釋成200 U·mL-1、400 U·mL-1、600 U·mL-1、800 U·mL-1和1 000 U·mL-1的鏈霉素標準溶液。精密吸取各濃度鏈霉素標準溶液2.5 mL于試管中，再加入2.5 mL水、1滴4%鹽酸羥胺、0.5 mL 2 mol·mL-1NaOH溶液，搖勻后置于沸水浴中加熱2 min，冷卻至室溫，再加入0.5%硫酸鐵銨試劑10 mL，搖勻，靜置5 min，測定520 nm處吸光度，測定3次，取平均值。以吸光度為橫坐標、鏈霉素效價為縱坐標繪制標準曲線，擬合得到線性回歸方程[7]。

1.3.2 發酵液效價的計算

吸取稀釋一定倍數的發酵液于離心管中，用1∶2硝酸將發酵液酸化至pH值約為3，于8 000 r·min-1離心10 min；吸取上清液2.5 mL兩份，分別置于2支試管中，向其中一支試管中加入4%鹽酸羥胺1滴作為空白對照；按1.3.1方法測定520 nm處吸光度，代入回歸方程，計算上清液效價；再根據稀釋倍數，計算發酵液效價。

1.4 發酵培養基氮源的優化

發酵培養基中主要有機氮源黃豆粉含有豐富的蛋白質、氨基酸和油脂，是造成培養基黏稠和產生泡沫的主要原因。為了讓菌絲更有效地附著在FBB的纖維床上，需要尋找能夠替代黃豆粉的氮源。因此，分別以黃豆粉、黃豆粉濾液(煮沸后過濾)、大豆蛋白胨、黃豆粉濾液+大豆蛋白胨為培養基氮源，比較發酵效果，確定最優氮源。

實驗培養基設計如下(g·L-1)：KH2PO40.65，(NH4)2SO48，NaCl 2.5，黃豆粉36(其它氮源以相同質量比計算)，葡萄糖65～85。

1.5 FBB發酵生產鏈霉素

將種子液按接種量10%接種于裝有滅菌發酵培養基的發酵罐內，于28 ℃通氣攪拌培養24 h后，連接纖維床反應器，將發酵液泵入，并開啟恒溫裝置，控制溫度為28 ℃。待菌體吸附完全后，視情況向發酵罐內補充新鮮料液。監測菌體量、pH值、鏈霉素效價等參數。

2 結果與討論

2.1 標準曲線(圖1)

從圖1可知，線性回歸方程為y=3709.9x-25.493，相關系數R2=0.9998。鏈霉素效價在200～1 000 U·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 鏈霉素的標準曲線

2.2 發酵培養基的替代氮源

由于黃豆粉中含有大量菌體生長所需蛋白質和氨基酸以及一定量的油脂和淀粉，因此在用可溶性氮源替代時，需要添加適量的碳源。按表1設計4組替代氮源F2～F5，F1為對照。將灰色鏈霉菌孢子接種至種子瓶，28 ℃振蕩培養48 h后，將種子液分別接種于裝有F1～F5氮源發酵培養基的發酵瓶，28 ℃振蕩培養，并從第72 h開始取樣測定效價，每個樣品測定3次，取平均值，結果如圖2所示。

表1 F1～F5氮源配比/(g·L-1)

圖2 灰色鏈霉菌在不同氮源發酵培養基中發酵不同時間的效價

從圖2可知，4種替代氮源中，只有在以F5為替代氮源的發酵培養基中的發酵水平與對照(F1)相當，且發酵144 h時的效價達到9 104 U·mL-1，超過了對照組；雖然在以F4為替代氮源的發酵培養基中的初始發酵水平最高，但隨著發酵時間的延長，發酵水平升幅明顯變緩。表明，大豆蛋白胨中氮源供給較為充足，完全可以滿足菌體生長需要；當大豆蛋白胨中加入黃豆粉濾液后，由于氮源過于豐富，可能導致菌體初期生長過快而快速衰退，引起后期產物合成不足。另外，補充適宜的碳源在發酵后期有利于鏈霉素合成。因此，選擇F5作為替代氮源。

2.3 FBB發酵生產鏈霉素

以F5作為發酵培養基的替代氮源，將培養好的種子液接種至發酵罐中，通氣比控制在0.5～1 vvm，攪拌轉速為200 r·min-1，28 ℃培養24 h后，菌體量迅速增加(圖3a)；連接纖維床反應器后，發酵液被蠕動泵泵入纖維床反應器中，菌體被纖維床反應器吸附；隨著吸附的進行，菌體和產生的次級代謝產物也在纖維床反應器上進行交換，新生的富有活力的菌體被吸附上去，而衰老的自溶的菌體脫落下來，同時代謝產物隨著清液回流至發酵罐內；大約循環吸附2 h后，菌體幾乎全部吸附至纖維床反應器上(圖3c)，發酵液同時變得澄清(圖3b)。

圖3 連接纖維床反應器前后發酵液和菌體照片

2.4 FBB發酵與傳統攪拌發酵生產鏈霉素的比較

以F5作為發酵培養基的替代氮源，分別利用FBB和傳統攪拌發酵生產鏈霉素，比較鏈霉素效價和還原糖含量，結果如圖4所示。

從圖4可知，FBB的初始發酵水平與傳統攪拌發酵的基本持平；隨著發酵時間的延長，發酵水平逐漸上升，在96 h時FBB發酵水平達到頂峰，為5 567 U·mL-1；但隨著發酵時間的繼續延長，FBB發酵水平急劇下降，而傳統攪拌發酵水平仍保持一定上升趨勢，144 h時達到8 180 U·mL-1；FBB發酵的還原糖含量在96 h后基本穩定在3.0 g·(100 mL)-1左右，而攪拌發酵的還原糖含量持續下降。推測還原糖利用度對后期鏈霉素合成影響顯著，FBB發酵的還原糖含量在96 h后基本穩定，因此導致發酵水平急劇下降。雖然從長周期發酵結果看，FBB發酵相對于傳統攪拌發酵還有一定差距，但在短周期范圍內，與傳統攪拌發酵水平基本相當。另外，FBB發酵的菌體幾乎全部吸附在纖維床反應器上，而發酵液保持澄清，為后期提取純化提供了便利。因此，FBB發酵生產鏈霉素較傳統攪拌發酵更具優勢。

圖4 FBB發酵與傳統攪拌發酵生產鏈霉素的比較

2.5 討論

目前，微生物發酵生產抗生素受到很多因素的制約，比如廢水排放、廢棄菌體處理等。傳統攪拌發酵采用的是分批發酵，產生的菌體量巨大；提取發酵液時要用過濾設備將菌體與清液分離；天然有機原料的使用帶來的發酵液黏度高、難過濾、能耗高等問題；過濾后大量濕菌體為有害物，不能隨意傾倒，需通過干燥、焚燒等方法進行處理，消耗大量的動力、蒸汽等。本研究采用FBB發酵生產鏈霉素，將灰色鏈霉菌吸附在纖維床反應器上，使其在固定化條件下生產鏈霉素，同時達到菌體和發酵液分離的效果。

黃豆粉是一種常用的價格低廉的優質氮源，但由于其固體不溶性物質含量高，容易造成培養基黏稠、泡沫多，從而加大過濾難度。為了增強菌體在纖維床反應器上的吸附，本研究對發酵培養基進行了改良，采用可溶性有機氮源大豆蛋白胨替代黃豆粉，并添加一定量蔗糖促進鏈霉素的合成。在大豆蛋白胨為18 g·L-1、蔗糖為20 g·L-1時可完全替代黃豆粉，為菌體生長提供足量易吸收的優質氮源，促進菌體生長和鏈霉素合成，搖瓶培養144 h的發酵水平達到9 104 U·mL-1，同時發酵液的黏度也大大降低。

利用FBB可以將菌體固定化，用于生產有機酸或酶，該方法在工業上已有規模化應用[8-11]，但應用于好氧菌的報道相對較少。本研究首次將FBB應用于鏈霉素發酵生產，將鏈霉素產生菌固定在棉質纖維上，發酵96 h時鏈霉素效價達到5 567 U·mL-1。由于菌體全部被固定，發酵液保持澄清，這不僅有利于從無菌體的發酵液中進行產物的提取和純化，也可以重復利用菌體生產次級代謝產物，從而縮短發酵周期，進一步提高鏈霉素在發酵過程中的體積生產率。

3 結論

采用可溶性有機氮源大豆蛋白胨替代黃豆粉，并添加一定量蔗糖促進鏈霉素的合成。在大豆蛋白胨為18 g·L-1、蔗糖為20 g·L-1時可完全替代黃豆粉，為菌體生長提供足量易吸收的優質氮源，促進菌體生長和鏈霉素合成，在1 L FBB中發酵96 h時鏈霉素效價達到5 567 U·mL-1。在整個發酵過程中，所有菌絲都附著在一起，而發酵液保持澄清。本研究初步探討了FBB發酵生產鏈霉素的可能性，如果未來能在FBB結構改進、工藝參數優化控制上取得突破，使其可以真正在發酵水平上趕超傳統攪拌發酵，做到菌體重復利用，那么這種新型的FBB將會解決目前困擾發酵工業發展的很多問題，真正做到綠色、環保、高效和低能耗。

(感謝河北省人社廳提供在俄亥俄州立大學訪學研究期間的資金支持！感謝華北制藥華勝有限公司提供在俄亥俄州立大學訪學研究期間的資金支持！感謝俄亥俄州立大學化學與生物分子工程系楊尚天教授及其實驗室成員對本研究的幫助！)